193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
zis-sorrendet kell hogy tartalmazzon, azonos kohézív végek jönnek létre, így a restrikciós endonukleázokkaí kezelt különböző szekvenciájú DNS-molekulák összekapcsolódhatnak (Roberts, Crit. Rév. Biochem., 4. 123, 1976). A restrikciós helyek általában ritkán fordulnak elő, azonban a restrikciós endonukleázok felhasználhatóságát nagymértékben erősíthetjük a restrikciós helyekre jellemző bázis-szekvenciókat tartalmazó kétszálas oligo-nukleotidok kémiai szintézisével. Ily módon gyakorlatilag bármely DNS szegmenst hozzákapcsolhatunk bármely más szegmenshez oly módon, hogy a megfelelő restrikciós oligonukleotidot hozzákapcsoljuk a molekula végéhez, majd az így előállított vegyületet a megfelelő restrikciós endonukleázzal hidrolizáljuk, és így előállítjuk a kohézív végű molekulákat (Heynekker, Shine, Goodman, Boyer, Rosenberg, Dickerson, Narang, Itakura, Lin és Riggs, Nature, 264, 748, 1976; és Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Bakura, Schience, 196, 177, 1977). Az SI jelű endonukleáz olyan enzim, amely hidrolizálja az egyszálú DNS foszfodiészter-kötéseit, vagy az egyébként kétszálú DNS egyszálú részeit vagy köralakú végeit (Vogt, Eur. J. Biochem., 33, 192, 1973)-. A DNS-ligáz katalizálja az 5’-foszfát- és a 3’-hidroxil-csoporttal rendelkező DNS-szegmensek közötti foszfodiészter-kötés kialakulását; ilyenek akkor alakulhatnak ki, amikor két DNS-darab kohézív végekkel kapcsolódik össze. Az enzim funkciója abban áll, hogy egyébként készálú DNS-molekulában lévő egyszálú részeket összekapcsoljon. Megfelelő körülmények között azonban a DNS-ligáz katalizálja két sérült végű molekula kovalens összekapcsolását (Sgaramella, Van de Sande és Khorana, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 67, 1468, 1970). Az alkálikus foszfatáz hidrolizálja a foszfát-észtereket, köztük a DNS 5’-terminális foszfátcsoportjait. A továbbiakban, mint az egész folyamat egy lépését ismertetjük egy különleges DNS-fragmens bevezetését egy DNS-vektorba, mint például egy plazmidba. A plazmidot olyan autonóm replikálódó DNS egységek elnevezésére használjuk, amelyek megtalálhatók a mikroorganizmusok sejtjeiben, és amelyek a gazdasejt genomjától függetlenül léteznek. A plazmid genetikailag nincs a gazdasejt kromoszómájához kapcsolva. A plazmid DNS kétszálú, gyűrűvé kapcsolódó molekulaként létezik, molekulasúlya általában néhány millió, bár néhány esetben 108 is lehet, és általában a sejt ossz DNS-tartalmának csak kis %-át képviseli. A plazmid DNS a gazdasejt DNS-étől a kettő közötti méretkülönbség alapján általában elkülöníthető. A plazmidok a gazdasejt osztódásától függetlenül replikálódhatnak, egyes esetekben a kutató szabályozhatja replikációjukat a növekedési kö5 4 rülmények változtatásával. Bár a plazmid zárt gyűrűként létezik, mesterséges eljárással bevezethetünk egy DNS szegmenset a plazmidba, amikor nagyobb molekulasúlyú rekombináns plazmidot kapunk, anélkül, hogy lényegesen befolyásoltuk volna azt a képeségét, hogy replikálódjon, vagy hogy kifejezhesse a benne hordozott információkat. Ily módon a plazmid igen jól használható arra, hogy egy DNS darabot átvigyünk egy új sejtbe. A rekombináns DNS technológiára használható plazmidok általában szelekciós célokra használható géneket tartalmaznak, például gyógyszerekre való rezisztenciát eredményező géneket. A találmány szerinti eljárás részletes szemléltetésére megadjuk a növekedési hormon génjének izolálását és átvitelét. Egy adott fehérje genetikai kódját jelentő specifikus bázis-sorrendű DNS-molekula előállításának ismeretében lehetségessé válik az adott nukleotid-sorrend módosítása kémiai vagy biológiai módszerekkel, amit követően a kódolt fehérje szerkezete szintén módosul. Ily módon előállíthatunk például olyan módosított inzulint, amely különleges gyógyászati igényeknek tesz eleget. A mikroorganizmusokat képessé tehetjük bármely olyan inzulinnal rokon aminosav-sorrendű fehérjék szintézisére, amelyek rendelkeznek az inzulin alapvető funkcionális tulajdonságaival. Hasonló meggondolások érvényesek a növekedési hormonok esetén is. Ha át tudjuk vinni egy magasabbrendű organizmus közönséges anyagcseréjében részt vevő jellegzetes fehérje genetikai kódját egy baktériumba, úgy lehetőségünk nyílik ennek a fehérjének a baktérium tenyésztésével való előállítására. Megnyílik annak lehetősége, hogy a találmány szerinti módon megváltoztatott mikroorganizmusok által szintetizált proteinnel helyettesítsük a magasabbrendű organizmus protein-igényét, amikor annak képessége ennek a proteinnek a termelésére megszűnt. Felmerül továbbá például annak a lehetősége, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus és az ember között szimbiotikus kapcsolatot létesítsünk krónikus vagy akut hiánybetegségek esetén, amikor a találmány szerinti eljárással genetikailag megváltoztatott mikroorganizmust beültethetjük, vagy más módon kapcsolatba hozhatjuk az emberrel, ez utóbbi patológiás anyagcsere-hiányának kompenzálására. A találmány tárgya eljárás genetikai információt tartalmazó különleges bázis-sorrendű nukleotidok izolálására, a különleges nukleotid-sorrendű DNS szintézisére és a DNS bevitelére egy mikroorganizmusba. A találmány szerint úgy járunk el, hogy (1 humán hipofízis-sejtekből mRNS-t izolálunk kaotrop kationt, kaotrop aniont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében végzet homogenizálással. 6 193866 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
