193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
-sorrendje megfelel egymásnak. Ezt az RNS-t hírvivő vagy messenger RNS-nek (mRNS-nek) nevezzük, mivel feladata a genetikai készlet és a fehérje-szintetizáló rendszer öszszekötése. A sejten belül az mRNS mintaként szerepel abban a komplex folyamatban, amelynek része a sejten belül lévő enzimek és sejtszervecskék sokszorozódása, amely a különleges aminosav-sorrendű fehérjék szintézisének az eredménye. Ez utóbbi folyamatot az mRNS transzlációjának (átfordításának) nevezzük. Számtalan olyan fehérje ismeretes, amelynek gyógyászati vagy kutatási jelentősége van, és amelyeket a magasabbrendű szervezetekben, például gerincesekben találhatunk meg, vagy azok szintetizálják őket. Ilyenek például az inzulin vagy más fehérje hormonok, mint például a növekedési hormon, továbbá a vérnyomás szabályozásban résztvevő fehérjék, ipari, orvosi vagy kutatási jelentőséggel bíró enzimek. Rendszerint igen nehéz megfelelő mennyiségű ilyen fehérjét előállítani az adott organizmusból például extrakcióval, és ez a nehézség különösen akut módon jelentkezik az emberi eredetű fehérjék esetén. Ezért van szükségünk olyan eljárásokra, amelyek segítségével ezeket a proteineket a magasabbrendű organizmus részvétele nélkül megfelelő mennyiségben rendelkezésre álló más sejtekben állíthatjuk elő. Bizonyos esetekben lehetséges megfelelő mennyiségű sejteket hosszú időn át a szövettenyésztés megfelelő módszereivel fenntartanunk. Azonban a szövettenyészetek sejtjeinek növekedése fgen lassú, a táptalaj drága, a tenyésztés körülményeit igen pontosan be kell tartanunk, ugyanakkor a kitermelés alacsony. Ezenfelül gyakran nagyon nehézkes egy olyan adott sejtvonal fentartása, amely a megkívánt jellemzőkkel rendelkezik. Ezzel szemben a mikroorganizmusok, mint például a baktériumok, viszonylag könnyen növeszthetők kémiailag meghatározott összetételű táptalajon. A fermentációs technológiák igen fejlettek, és jól szabályozhatók. A mikroorganizmusok növekedése gyors és magas kitermelés érhető el. Ezenfelül bizonyos mikroorganizmusok genetikusán jól jellemezettek, más szóval a legjobban jellemzett és legismertebb organizmusok közé tartoznak. A fentiek alapján igen előnyös egy olyan gén bejuttatása egy megfelelő organizmusba, amely orvosilag jelentős fehérjét határoz meg. Ezen a módon az eredetileg magasabbrendű organizmusban szintetizálódó fehérjét nagy mennyiségben állíthatjuk elő szabályozott körülmények között növesztett mikroorganizmusokkal. Ugyancsak lehetséges ily módon a megfelelő protein olcsó előállítása. További előnyt jelent, hogy az adott protein termelését meghatározó genetikai kód izolálásával és átvitelével a jól ismert genetikai háttérrel rendelkező mikroorganizmusba, 3 tanulmányozhatjuk a protein szintézisének szabályozását és a szintézis utáni sorsát. Ezenkívül az izolált genetikai kód (DNS) szekvenciájának változtatásával előállíthatunk olyan új bázissorrendet, amely különböző, más terápiás vagy funkcionális tulajdonságokkal rendelkező proteineket határoz meg. A találmány szerinti eljárással a fenti célok at elérjük. Az eljárást enzimek által katalizált reakciókat magába foglaló lépések komplex sorozatán át ismertetjük. Az enzimreakciók természetét, amennyire ezeket az irodalom a'apján ismerjük, részletesen tárgyaljuk A reverz transzkriptáz az RNS templáttal komplementer DNS szintézisét katalizálja az RNS templát, egy oligo-dezoxi-nukleotid primer és négy dezoxi-nukleotid-trifoszfát, a dATP, dGTP, dCTP és a TTP jelenlétében. A reakció úgy indul,hogy az oligo-dezoxi-nukleotid primer nem-kovalensen kötődik az mRNS molekula 3’végéhez, majd az mRNS nukleoti J-sorrendjének megfelelően lépésenként hozzákapcsolódnak a növekvő lánc 3’-végéhez a megfelelő dezoxi-nukleotidok. Az így létrejövő molekulát hajtű-szer kezeiként Írhatjuk le, amely tartalmazza az eredeti RNS-t és egy egyszálú DNS hurokkal hozzákapcsolódó komplementer DNS-láncot. A reverz transzkriptáz ugyancsak katalizálja azt a reakciót, amely templátként (mintaként) egyszálú DNS-t használ, és amikor olyan kétszálú hajtű-szerű, DNS molekula jön létre, amelynek a végein egyszálú DNS hurkot találunk [Aviv és Leder, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69, 1408, 1972; és Efstratiadis, Kafatos, Maxam és Maniatis, Cell, 7, 279, 1976], A restrikciós endonukleázok olyan enzimek, amelyek a kétszálú DNS molekula foszfodiészter-kötéseit hidrolizálják, ezzel a DNS-l.íncban töréseket hoznak létre. Ha a DNS molekula zárt körként létezik, úgy az az enzimek hatására lineáris szerkezetűvé alakul át. Alapvető tulajdonsága ezen enzimeknek, hegy a hidrolitikus hatás csak különleges nukleotid-sorrenddel rendelkező molekula részeken következik be. Ezeket a bázis-sorrendeket a restrikciós endonukleázok felis nerik. Különböző forrásokból izoláltak restr kciós endonukleázokat, és oly módon jellemezték őket, hogy meghatározták azokat a nukleotid-sorrendeket, amelyeket felismerne k. Egyes restrikciós endonukleázok mindkét szálon hasonló ponton hidrolizálják a íoszfo iiészter-kötéseket, amikor serült végű molekulák jönnek létre. Más enzimek néhány nrkleotiddal egymástól elválasztott kötéseket hidrolizálnak, amikor a megtámadott molekula mindként végén szabad egyszálas szakaszok jönnek létre. Ezek az egyszálas végek önmaguk komplementerjei, kohézív erőkkel újra összekapcsolhatják a hidrolizált DNS-t. m vei bármely, ezen enzimekre érzékeny DNS-rrolekula azonos, a felismerést elősegítő bá4 3 193866 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
