193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 báció után egy percen át 200 g nehézségi gyorsulással . centrifugálunk. A felülúszót kiöntjük, az üledéket Hank-oldattal mossuk, majd ezt 5 alkalommal megismételjük. Az utolsó centrifurálás után 15 ml Ficoll-ban (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Svédország) szuszpendáljuk az üledéket (a,használt Ficoll sűrűsége 1,085). Ezután 8 ml 1,080 sűrűségű Ficoll-t, majd 5 ml 1,060 sűrűségű Ficoll-t rétegezünk a szuszpenzióra, majd 5 percen át 5000, majd 5 percen át 2000 g nehézségi gyorsulással centrifugáljuk szögrotorban. A centrifugálás eredményeképpen az egyéb sejtek a centrifugacső alján maradnak, míg a Langerhans sejtek a gradiens mentén felemelkednek, és a két felső réteg között egy sávot alkotnak. A Langerhans sejteket tartalmazó rész ganglionsejtekkel, limíomasejtekkei és szövetsejtekkel van fertőzve. A nagyméretű fertőző fragmenseket magában a centrifugacsőben távolítjuk el. Az így kapott készítményt mikroszkóp alá helyezzük, és az ott látható fertőző anyagokat kézzel, mikropipettával távolítjuk el. Ezután Hank-oldattal hígítjuk a sejtkészítményt és centrifugáljuk. A felülúszót kiöntjük, a sejteket tartalmazó üledéket pedig folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk. 4 mólos guanidium-tiocianátban (Tridom; Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Svájc), amely 1 mól ß-merkaptoetanolt tartalmaz, és amelynek pH-ját 5,0-re állítottuk be, és 4 C° hőmérsékletre hűtöttük, 200 patkányból származó Langerhans sejteket homogenizálunk. A homogenizátumot 1,2 ml, 100 mM EDTA-t tartalmazó 5,7 mólos céziumkloridra rétegezzük, majd 18 órán át 15 C° hőmérsékleten 37 000 percenkénti fordulat mellett Beckman ultracentrifugában SV 50,1 rotorban centrifugáljuk. (Beckman Instrument Company, Fullerton, California, Egyesült Államok). Az RNS a centrifugacső alsó részén gyűlik össze. A poliadenilezett RNS-t a teljes RNS frakcióból oligo-(dT)-cellulóz oszlopon végzett kromatográfiával különítjük el Aviv és Leder módszere (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69, 1408, 1972) szerint. A patkány Langerhans sejtjeiből izolált teljes poliadenilezett RNS átmásolására cDNS-é mieloblasztózis vírusból izolált reverz transzkriptáz enzimet használunk; az enzimet Beardtól kaptuk (Life Science Inc., ST. Petersburg, Florida, Egyesült Államok): a reakciót 50 mM pH 8,3 trisz-HCl-t, 9 mM magnéziumkloridot, 30 mM nátriumkloridot, 20 mM ß-merkaptoetanolt, egyenként 1 — 1 mM-nyi három nem radioaktív dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot, 250 pM negyedik, a—p32 jelzett (specifikus aktivitás 50—200 c/mól) dezoxi-nukleozid-trifoszfátot, 20 pg/ml oligo dT12_lg-t (Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok), 100 pg/ml poliadenilezett RNS-t és 200 E/ml reverz transzkriptáz enzimet tartalmazó reakció-21 elegyben végezzük. A reakcióelegyet 45 C° hőmérsékleten 15 percen át inkubáljuk. Ezután 25 mM EDTA—Na2—t adunk hozzá, majd azonos térfogatú vízzel telített fenollal extraháljuk. Elkülönítjük a vizest fázist, majd 0,3 cm átmérőjű és 10 cm magas Sephadex G—100 gyantából készült kromatográfáló oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 10 mM trisz-HCl-ot, pH 9,0, 100 mM nátriumkloridot és 2 mM EDTA-t tartalmazó eleggyel egyensúlyozzuk ki. A nukleinsavat etanollal csapjuk ki az eluátumból, miután 0,25 M pH 6,0, ammóniumacetátot adtunk hozzá. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, a centrifugálás után kapott üledéket 50 pl frissen készített 0,1 M nátriumhidroxid oldatban oldjuk, majd az RNS hidrolízisére 20 percen át 70 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1 mólos pH 4,5 nátriumacetátot adunk az oldathoz annak semlegesítésére, majd a cDNS-P32-t etanollal kicsapjuk, és vízben újra oldjuk. Az egyszálú cDNS alikvot mintáit poliakril-amid gélen analizáljuk Dingman és Peacock módszerével (Biochemistry, 7, 659, 1968). A gélt megszárítjuk, majd a DNS—P32-t Kodak No-Schreen NS—2T filmmel (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York, Egyesült Államok) kivitelezett autoradiográfiával határozzuk meg. A cDNS heterodiszperz, ahogy azt az elektroforézises vizsgálat jelzi. A termék túlsúlyban körülbelül 450 nukleotidból álló cDNS molekulákat tartalmaz, amint azt ismert anyaggal való összehasonlítás alapján kimutattuk. 2. példa Ismertetjük a patkány inzulin genetikai kódját tartalmazó kettős szálú cDNS szintézisét és jellemzését. Az 1. példa szerinti módon előállított egyszálú cDNS terméket a komplementer szál szintézise céljából reverz transzkriptáz enzimmel kezeljük. A reakciót a következő vegyületeket tartalmazó reakcióelegyben végezzük: 50 mM trisz-HCl, pH 8,3. 9 mM magnéziumklorid, 10 mM ditio-treitol, egyenként 50—50 mM a három nem jelzett dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátból, 1 mM a—P32-jelzett nukleozid-trifoszfát (specifikus aktivitás 1 —10 c/mM), 50 pg/ml cDNS és 220 E/ml reverz transzkriptáz. 120 percen át 45 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A reakciót 25 mM EDTA—Na2 adagolásával állítjuk le, majd fenollal extraháljuk, és az extraktumot Sephadex G—100 oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumból a terméket etanollal kicsapjuk. A reakciótermék egy alikvot mintáját, amelynek aktivitása 500 cpm 1000 cpm közé esik, az 1. példában megadottak szerint gél-elektroforézissel vizsgáljuk. 450 nukleotidnak megfelelő helyen egy heterodiszperz sáv látható (sztenderd mintákkal való összehasonlítás alapján). Az 1. és 2. példákban megadottak szerinti előállított DNS alikvot mintáit fölös 22 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 55 12
