193838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fiziológiailag aktív vegyületek mikrobiológiai úton való előállítására
193838 A jelen találmányt a továbbiakban az alábbi példákkal szemléltetjük, amely példáknak nem az a szándéka, hogy korlátozzák a találmány oltalmi körét. Azok számára, akik a szakterületen jártasak, nyilvánvaló, hogy különböző változtatásokat és módosításokat lehet véghezvinni a nélkül, hogy a találmány szellemén és oltalmi körén kívül esnének. 1. példa 2,5% glicerint, 0,5% marhahúskivonatot (a Kyokuto K.K terméke), 0,5% peptont, 1,0% élesztőkivonatot (az Oriental KK terméke), 0,2% NaCl-t, 0,05% MgS04-7H20-t, 0,32% CaC03-at, 0,05% Silicon-KM70 (a Shinetsu Kagaku K.K terméke) — szójaolaj (JP) 1:1 keveréket, mint habgátlószert tartalmazó tápközeget sterilezünk autoklávban 120°C hőmérsékleten 20 percen át. Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba 120 ml-es adagot teszünk a sterilezett tápközegből, amelyet azután egy kacsnyi Plipostatin-termelő törzzsel (FERM-P7843) inokulálunk. Az inokulált tápközeget 27°C hőmérsékleten inkubáljuk egy napon át forgó rázógépen (180 fordulat/perc). Az így nyert oltótenyészet 1 ml-es adagját azután 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át, amely 120 ml fentebb említett sterilezett tápközeget tartalmaz, és rázás közben tenyésztjük egy napon át ugyanolyan körülmények között, mint amelyet fentebb leirtunk. A tenyészközeget pH 7,4-nél szűrjük, hogy eltávolítsuk a sejteket, és így 18 liter szürletet nyerünk. A szürlet IC50 értéke a foszfolipáz D gátlásához 32 pl/ml. A szűrletet egy oszlopon engedjük át, amely Amberlite XAC-7-tel (2 liter) van töltve, hogy adszorbeáljon bármilyen enzimgátló vegyületet. Az oszlopot azután vízzel (8 liter) és 80%-os metanollal (4 liter) mossuk, hogy összegyűjtsük az aktív anyagot tartalmazó frakciókat. A kombinált frakciókat csökkentett nyomáson szárazra koncentráljuk, így 24,6 g barna nyers port kapunk, amelynek IC50 értéke 18 pg/ml. Az így nyert nyers por n-propanollal képzett oldatát egy n-propanollal töltött szilikagél-oszlopon (1 liter) engedjük át, ezt követi egymás utáni elűció n-propanollal (800 ml), 90%-os n-propanol-oldattal (2 liter) majd 80%-os n-propanollal, a frakciókat azután vákuumban szárazra koncentráljuk. Plipostatin Bret és B2-t tartalmazó barna port (2,15 g) (IC50= = !5j-tg/ml) nyerünk a 90%-os propanolla! eluált frakciókból, és Plipostatin Áret és A2-t tartalmazó barna port (2,0 g) (IC50 = = 9,5 pg/ml) nyerünk a 80%-os propanollal eluált frakciókból. Az így nyert „A“ csoportbeli anyagokat tartalmazó barna port szilanizált szilikagélt (400 ml) tartalmazó oszlopon engedjük át, amelyet előzőleg metanol és ecetsavas puffer (1% káliumacetát és 3% ecetsav, pH 5) 6:4 arányú keverékével töltöttünk fel, és ugyanezzel a keverékkel végezzük az eluálást, hogy az aktív anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtsük. Az egyesített frakciókat azután csökkentett nyomá- 10 17 son szárazra koncentráljuk. Az így létrejött szilárd anyagot feloldjuk kis mennyiségű 80%-os metanolban, és az oldatot sómentesítési műveletnek vetjük alá a kálium-acetát fölösleg eltávolítására Sephadex LH—20 oszlopon, amelyet 80% metanollal eluálunk. Az aktív anyagokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra koncentráljuk, 994 mg halványsárga port kapva (IC50 = 9,5 g/ml). Az így nyert port átengedjük nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon (HPLC) (a Senshu Kagoku K.K terméke; Nucleosil 5 C18 200 X 300 m/m; áramlási sebesség: 8 ml/perc), amelyet előzőleg acetonitríl és ecetsav puffer (2% kálium-acetát és 6% ecetsav, pH 4) 1:1 arányú keverékében egyensúlyoztunk ki, ezt követően az említett kiegyensúlyozó folyadékkal eluálunk, hogy Plipostatin Aret, illétve Plipostatin A2-t tartalmazó frakciókat gyűjtsünk. A kombinált frakciókat szárazra koncentráljuk, és az így létrejött szilárd anyagokat sómentesítjük ugyanazt a módszert alkalmazva, mint amelyet a szilanizált szilikagél oszlopról nyert eluátumnál alkalmaztunk, ezáltal 542 mg Plipostatin A,-et (IC50 = 2,1 pg/ml kapunk színtelen por formájában, és 152 mg Plipostatin A2-t kapunk (IC50 = 3,8 pg/ml), szintén színtelen por formájában. A jelen találmány szerinti B csoportot (B, és B2) tartalmazó barna port, amelyet a 90%-os n-propanolos eluáló frakcióból nyerünk, szintén átengedjük szilanizált szilikagél-oszlopon (200 ml), amelyet előzőleg 40%-os metanollal töltöttünk föl, majd ezt követően először 40%-os metanollal (1,5 1), majd 50%-os metanollal (1,5 1) eluálunk, hogy összegyűjtsük az aktív anyagokat tartalmazó frakciókat. A kombinált frakciókat azután szárazra koncentráljuk. A maradékot kis mennyiségű 80%-os metanolban oldjuk, és az így létrejött oldatot Sephadex LH-20 oszlopon engedjük át, ezt követi az eluálás 80%-os metanollal, hogy az aktív vegyületeket tartalmazó frakciókat összegyűjtsük; ezeket azután szárazra koncentráljuk, így 545 mg halványsárga port kapunk, (IC50 = 8 pg/ml). Az így nyert port azután HPLC-hez szolgáló oszlopra (Nucleosil 5 Cl8 20 0 X 300 m/m; áramlási sebesség: 8 ml/perc) visszük föl, amelyet előzőleg acetonitríl és ecetsav puffer (2% kálium-acetát és 6% ecetsav, pH 4) 65:35 arányú keverékével egyensúlyoztunk ki, ezután az eluálást a fentemlített kiegyensúlyozó folyadékkal végezzük el, hogy olyan frakciókat gyűjthessünk, amelyek Plipostatin B,-et és B2-t tartalmaznak. A megfelelő frakciókat szárazra koncentráljuk. A koncentrálási maradékokat sómentesítjük, eluálva ezeket 80%-os metanollal Sephadex LH—20 oszlopról. Ilyen módon 151 mg Plipostatin B,-et (IC50 = 2,8 pg/ml) kapunk színtelen porként, és 89 mg Plipostatin B2-t (IC50 = 3,3 pg/ml), szintén színtelen porként. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
