193838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fiziológiailag aktív vegyületek mikrobiológiai úton való előállítására
193838 1. referenciapélda A következő kémiai kísérleteket és műszeres elemzéseket hajtjuk végre abból a célból, hogy meghatározzuk a jelen találmány szerinti vegyületekben resztvevő zsírsavak szerkezetét. A jelen találmány szerinti Plipostatin A,-et vagy B,-et metanolízisnek vetjük alá 30% HCl/metanolban 50°C hőmérsékleten 2 napon át, majd szárazra koncentráljuk. Az így létrejött maradékot dietil-éterrel extraháljuk. Az extraktumot azután vékonyréteg-kromatográfiának vetjük alá [(ezt ezentúl TLC-vel jelöljük (szilikagélen; a kifejlesztő oldószer: kloroform/metanol (50:1)], hogy elkülönítsük a metanolízis termékeit. A termék műszeres elemzése NMR-rel és tömegspektrometriával azt mutatja, hogy a jelen találmány szerinti Plipostatin A,-ben és B,-ben résztvevő zsírsav ß-hidroxi-hexadekän-sav (ß-hidroxipalmitinsav). A fentiek szerinti módszerrel azonos módon a jelen találmány szerinti Plipostatin A2-ben és B2-bén résztvevő zsírsavat is meghatározzuk, ez ß-hidroxi anti-izohexadekánsavnak (ß-hidroxi-anti-izopalmitinsav) bizonyul. 2. referenciapélda A következő enzimes és kémiai elemzéseket hajtjuk végre, hogy meghatározzuk a ß-hidroxi-zsirsavat és a C-végen levő izoleucint, amely a jelen találmány szerinti lakton-gyűrűt képzi. A jelen találmány szerinti inhibitorokat karboxi-peptidáz Y-nal emésztjük az alábbi két módszerrel összhangban, és az emésztéssel felszabadult aminosavat megvizsgáljuk. A karboxipeptidáz Y-nak az a képessége, hogy egymás után hasítja le az aminosavakat a szekvencia végéről, így a C-végi aminosavat szabadítja fel. 19 Az említett két módszer. (i) Közvetlen emésztés az enzimmel, mindenféle előkezelés nélkül; vagy (ii) Enzimes emésztés az inhibitorok lakton-5 gyűrűjének alkálival végzett kinyitása után. A következő két eredmény a fenti megfelelő módszerek végrehajtása után alakul ki: (i) Nincs kimutatható szabad aminosav, illetve (ii) Ile, Tyr és Glu szabadul fel, ebben a sorrendben. Ezeknek az adatoknak az alapján a jelen 15 találmány feltalálói igazolják, hogy a C-végi aminosav Ile, és azt is igazolják, hogy a C-végnél laktongyűrű alakul ki. A laktongyűrű képzésére képes funkcióná- 20 lis csoportok a C-végi Ile-vel a zsírsav hidroxicsoportjai, a két Tyr és a Thr. Amikor a jelen találmány szerinti inhibitorokat acetilezésnek vetjük alá ecetsav-anhidriddel piridines oldatban, a két Tyr és a Thr hidroxicsoportjai 25 acetileződnek, amint ezt a nyert acetilszármazékok NMR- és tömegspektrumai bizonyítják. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a C-végi Ile a zsírsav ß-hidroxi-csoportjával képez laktont. 30 (4) Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra a jelen találmány szerinti Plipostatin A, NMR-spektruma, dimetil-szulfoxid-D6-ban mérve 50°C hőmérsékleten. 35 A 2., 3. és 4. ábrák a Plipostatin A2, B,, illetve B2 NMR spektrumai, az 1. ábránál ismertetett feltételek közt mérve. 20 40 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1.) Eljárás RrCH-CH2CO-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-R2-Pro-Gln-Tyr-Ile 0 általános képletű vegyületek — a képletben R, jelentése CH3(CH2),2- vagy CH3—CH2— —CH—(CH2)10 képletű gyök, és CH3 R2 jelentése Alá vagy Val, és a Glu, Orn, Thr, Pro, Gin, Ile, Ala és Val jelentése glutaminsav, ornitin, tirozin, treonin, prolin, glutamin, izóleucin, alanin, illetve valin gyök — és farmakológiailag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Bacillus cereus fajba tartozó valamely mikroorganizmust aerob körülmények között megfelelő tápközegben tenyésztünk, majd a tenyészközegben termelődő és felhalmozódó, fenti vegyületet hagyományos kromatográfiás módszerekkel kinyerjük. 2.) A 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést folyékony tápközegben hajtjuk végre, amely tápanyagként szénforrásokat, nitrogénforrásokat és kívánt esetben szervetlen sókat és/vagy habgátló szereket tartalmaz, 25°C—30°C közti hőmér- 50 sékleten, és a keletkezett anyagot a tenyészközegből kromatográfiával nyerjük ki aktív szénnel, szilikagéllel, ioncserélő gyantákkal vagy nem-ionos adszorbens gyantákkal. 3. ) A 1. vagy 2. igénypont szerinti eljá- 55 rás azzal jellemezve, hogy törzsként a Bacillus cereus FERM 7843-törzset alkalmazzuk. 4. ) Eljárás farmakológiai kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy aktív alkotórészként az 1. igénypontban meghatáro-60 zott és az 1. igénypont szerinti eljárással kapott vegyületet vagy farmakológiailag elfogadható sóját valamely ismert hordozóanyaggal összekeverjük és adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk. 4 lap rajz, 4 ábra lt
