193838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fiziológiailag aktív vegyületek mikrobiológiai úton való előállítására
193838 7 1. TÁBLÁZAT (folytatás) 8 Tulajdonság Faj BMG 302-ÍF67 B. cereus B. coagulans Növekedési hőmérséklet 10°C^37°C 10-20°C -35-45°C 12-25°C~55-60°C Savképződés L-arabinózból, D-xilózból és D-mannitból . d Anaerob növekedés + + + Nitrát redukciója + + d C-ram-f estés + + + Kataláz + + + Zselatin hidrolízise + +Növekedés 7% NaCl-t tartalmazó tápközegen + + — részletesen megmagyarázzuk. A jelen találmány szerinti eljárásnál Plipastatinok előállítására a fentebb leírt törzset először aerob körülmények között tenyésztjük olyan tápközegen, amely a baktériumok számára hozzáférhető tápközegeket tartalmaz. A baktériumok tenyésztéséhez hagyományosan alkalmazott tápanyagokat lehet alkalmazni tápanyagforrásként. így pl. szénforrásként szénhidrátokat, mint pl. glicerint, glükózt, laktózt, szacharózt, keményítőt, maltózt, melaszt, valamint zsírokat lehet alkalmazni egyenként, vagy kombinálva. Tipikus szervetlen és szerves nitrogénforrások, amelyeket fel lehet használni, az ammónium-klorid, ammónium-szulfát, karbamid, ammónium-nitrát, nátrium-nitrát, pepton, huskivonat, kukoricalekvár, szójaliszt, gyapotmagolaj-pogácsa, zabliszt. Kazaminosav, Bacto-szójakivonat, oldható növényi fehérjék, és ezek keverékei. Ha szükséges, szervetlen sókat, pl. nátrium-kloridot, magnézium-szulfátot, réz-szulfátot, vas-szulfátot, cink-szulfátot, mangán-kloridot, kalcium-karbonátot- és foszfátot, valamint más olyan szerves és szervetlen anyagokat, amelyek a jelen találmány szerinti törzs növekedését és Plipostatinok képződését elősegítik, adhatunk a tápközeghez. A tenyésztés előnyös módszere a folyékony tenyészet, különösen a süllyesztett tenyészet. A tenyésztést előnyösen 25 és 30°C hőmérséklet közt hajtjuk végre, és megközelítően semleges pH-n. A fiziológiailag aktív Plipostatin vegyületek a tenyésztő tápközegben keletkeznek és gyülemlenek fel a tenyésztés végrehajtása során, általában 1—2 nap alatt, 30 ha folyékony tápközeges módszert alkalmazunk. A tenyésztést akkor állítjuk le, amikor a tenyészközegben termelt Plipostatinok mennyisége maximumot ér el. A sejteket ekkor leszűrjük, majd a szóban forgó ter- 35 méket az így keletkezett szürletből izoláljuk és tisztítjuk. A Plipostatinok előállításának megfigyelését a tenyésztés és a tisztítási lépések során a foszfolipáz D elleni aktivitás mérésével 40 végezzük a következő módszerrel összhangban. A foszfolipáz D elleni aktivitás mérését Okuyama és munkatársainak módszerével végezzük [Okuyama A., Nishikiori T., Aoyagi T., és Umezawa H.: Biochemistry Inter- 45 national, 4, 417(1982)]. Dipalmitoil-foszfatidi 1 -kolint (DPC) (200 mmól/1) és kolin-metil-,4C-DPC-t (4-104 dpm (decay per minute)/szuszpendálunk ultrahangos kezeléssel 390 pl 50 mmó!/l-es trisz-HCl pufferban 0 (pH 5,7), amely 50 mmól/1 kalcium-kloridot is tartalmaz. Az így létrejött szuszpenzióhoz 10 pl olyan oldatot adunk, amely a vizsgálandó mintát tartalmazza. Az így létrejött keverékhez kereskedelemben rendelkezésre álló 55 foszfolipáz D (káposztából származó) 100 pl-nyi oldatát adjuk és 37°C hőmérsékleten 20 percen át reagáltatunk. A reakciót ezután leállítjuk 1,5 ml kloroform-metanol-tömény sósav keverékével [2:1:0,02 (térfo- 60 gat/térfogat) ]. Ehhez a keverékhez azután 1 ml, 0,1 mól/1 kálium-kloridot tartalmazó 50%-os metanolt adunk, és a keveréket összekeverjük. A két réteget centrifugálással elkülönítjük. Az enzim által a felső ré- 05 tegből felszabadított kolin radioaktivitását (a) mérjük. Vak vizsgálatként mérjük a minta 5
