193838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fiziológiailag aktív vegyületek mikrobiológiai úton való előállítására
193838 nélküli puffer radioaktivitását is. A foszfolipáz aktivitás százalékos gátlását a következő képlet szerint számoljuk ki: [(b—a)/ /b] X 100. Az IC50 értékek olyan minta-koncentrációnak felelnek meg, amelyek 50%-os gátlást adnak. A termék izolálását és tisztítását a tenyészközeg szűrletéből bármilyen olyan hagyományos módszerrel végrehajthatjuk, amelyet mikroorganizmusok metabolitjainak izolálásához szoktak használni tenyészközegeik szűrletéből. A Plipastatinok oldhatók vízben, metanolban, etanolban és n-propanolban, míg oldhatatlanok vagy gyengén oldhatók a.szokásos szerves oldószerekben, mint pl. acetonban. így a Plipastatinokat lehet bármilyen olyan módszerrel tisztítani, amelyet vízoldható savas vegyületek tisztítására használnak, így pl. adszorpciót aktivált szénporra vagy porózus gyantákra és azokról való leoldást, vagy oszlopkromatográfiát szilikagéllel, szilánozott szí likagéllel (Silanized*') vagy SephadexR LH-20-szal lehet alkalmazni egyedül vagy kombinációban. Példaként a Bacillus cereus BMG 302^ -fF67 tenyészközegének szűrletét Amberlir XAO-7-tel kezeljük, hogy adszorbeáljuk a szóban forgó vegyületeket. Vízzel való mosás után a gyantát 80%-os metanollal eluáljuk, így nyers barna port kapunk, amely a szóban forgó vegyületeket tartalmazza. Ez a jelen találmány szerinti Plipostatin A és B csoportjainak mind a négy vegyületét tartalmazza. Az egyes vegyületek izolálását a következő módon hajtjuk végre. A fentebbi módon nyert nyers por n-propanolos oldatát olyan szilikagél-oszlopon engedjük át, amelyet előzőleg n-propanollal egyensúlyoztunk ki, majd vizes n-propanol oldattal eluálunk, fokozatosan változó víztartalommal, hogy a Plipastatin A csoportjának vegyületeit (A, és A2) elkülönítsük B csoportjának vegyületeitől, ahogyan ezt később meghatározzuk. Az így nyert Plipastatin A csoportot SilanisedR szilikagélen kromatografáljuk, amelyet előzőleg 1% kálium-acetát + 3% ecetsav vizes oldatának és metanolnak 4:6 arányú keverékével kiegyensúlyoztunk, majd eluáljuk azonos oldószer-keverékkel, hogy összegyüjtsük a szóban forgó terméket tartalmazó frakciókat. A frakciókat 9 azután sómentesítjük SephadexR LH-20-szalr koncentráljuk és fagyasztva szárítjuk. Az így nyert port azután nagynyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá (HPLC) olyan oszlopon, amelyet előzőleg 2% kálium-acetát -j- 6% ecetsav vizes oldatának és acetonitrilnek 1:1 arányú keverékével egyensúlyoztunk ki. A HPLC-vel nyert, a szóban forgó terméket tartalmazó frakciók mindegyikét SephadexR LH20-al kezeljük, hogy a benne levő kálium-acetátot eltávolítsuk, majd ezután a megfelelő frakciókat koncentráljuk és fagyasztva szárítjuk, így a Plipastatin A, vagy A2 káliumsóját nyerjük fehér porként. Az említett, szilikagélen végzett oszlopkromatográfiával nyert Plipastatin B csoportot (beleértve a B,-et és a B2-t) szintén SilanizedR szilikagélen kromatografáljuk, amelyet előzőleg 40%-os metanol-oldattal egyensúlyoztunk ki, ezt követően azonos metanolos oldattal eluálunk, hogy a szóban forgó terméket tartalmazó frakcióka| összegyüjtsük, amelyeket azután SephadexR LH-20- -szal sómentesítünk, koncentrálunk és fagyasztva szárítunk. Az így létrejött port azután ugyanolyan HPLC kezelésnek vetjük alá, mint amelyet az A csoport vegyületeinek szétválasztásánál alkalmaztunk, így a Plipastatin B,-et a B2-től elkülönítjük. A Plipastatin B,-etR vagy B2-t tartalmazó frakciókat SephadexK LH20-szal kezeljük, koncentráljuk és fagyasztva szárítjuk, így a Plipastatin B, vagy B2 kálium-sóját kapjuk fehér porként. Az így nyert, jelen találmány szerinti megfelelő vegyületeket valamilyen alkálival elszappanosítjuk és tömegspektrometriás vizsgálatnak vetjük alá. A spektrumban megjelenő molekulaionok fragmensei azt mutatják, hogy a vegyületek mindegyikének a következő aminosavszekvenciája van az N-terminálistól: Glu, Orn, Tyr, Thr, Glu, Alá, (vagy Val), Pro, Gin, Tyr, és Ile. Az ÍR spektrumban megjelenő lakton-gyűrű jelenléte azonban azt is mutatja, hogy a ß-hidroxi-alifás sav az aminosav-spektrum C-terminálisához kapcsolódik. Ezeknek az adatoknak az alapján a jelen találmány szerinti vegyületek szerkezeteit a fentiek szerint azonosítjuk. A jelen találmány szerinti vegyületek fizikokémiai tulajdonságait az alábbi 2. Táblázatban foglaljuk össze. (Az összes mérést a vegyületek kéliumsójával hajtjuk végre, hacsak másképpen nem jelezzük). 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6
