193833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karboxipeptidáz-b-enzim immobilizálására
1 A találmány tárgya új eljárás karboxipeptidáz B enzim immobilizálására. Az immobilizált kaboxipeptidáz B enzimkészítmények fehérjék és peptidek COOH-terminális aminosavjainak meghatározására, továbbá D,L-arginin és D,L-lizin ipari méretű rezolválására használhatók fel. Az ipari felhasználhatóság szempontjából az immobilizált enzirríkészítményekkel szemben támasztott alapvető követelmények a következők: — az enzim készítmények tartós felhasználásra alkalmasak legyenek, azaz a készítmények enzimaktivitása többszöri felhasználás után ne csökkenjen jelentős mértékben; — az enzimhordozó kémiailag közömbös, mikroorganizmusok hatásának korlátlanul ellenálló, jó mechanikai tulajdonságokkal rendelkező, nagy átfolyási sebességet biztosító anyag legyen; — az enzim enyhe reakciókörülmények között, jelentős károsodás és aktivitásveszteség nélkül kapcsolható legyen a hordozóanyaghoz. A szakirodalomban többféle immobilizált karboxipeptidáz B enzimkészítményt ismertettek. Az Adv. Exp. Med. Bioi. 8, 23-30 (1970) közlemény maleinsav-anhidrid — etilén kopolimeren immobilizált humán karboxipeptidáz B-t, valamint Sepharose 4B gélen immobilizált sertés karboxipeptidáz B-t ismertet. A 2 553 649 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsátási irat cellulóz-triacetát membránon és Millipore szűrőn immobilizált karboxipeptidáz B enzimkészítményekről számol be. A Proc. Nat. Acad. Sei. US 52, 833 (1964) közlemény szerint a karboxipeptidáz B-t glutáraldehiddel immobilizálják, intermolekuláris keresztkötések kialakításával. Ezek az ismert immobilizált karboxipeptidáz B enzimkészítmények a felsorolt követelményeknek nem tesznek maradéktalanul eleget. Az ismert enzimkészítmények alapvető hátránya, hogy vagy a hordozóba beágyazva, vagy a hordozóhoz laza van der Vaals kötésekkel rögzítve tartalmazzák az enzimet, így aktivitásuk viszonylag rövid ideig tartó használat után is rohamosan csökken. Az intermolekuláris keresztkötések kialakításával immobilizált enzimkészítmények esetén hátrányt jelent, hogy az enzim szerkezetileg károsodik, így aktivitásának jelentős része elvész. A karboxipeptidáz B-től eltérő szerkezetű karboxipeptidáz A enzimet már immobilizálták polimer hordozón, kémiai kötések kialakításával. Hordozóként Enzacryl AH-t (hidrazincsoportokat tartalmazó akril polimer) használtak, amit az enzim felvitele előtt savas közegben nátrium-nitrittel aktiváltak (Acta Pol. Pharm. 1980/6/, 685-692, ref. Chem Abstr. 95, 164 697v (1981)). Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy ha a karboxipeptidáz B enzimet akrilsav és/ 2 2 /vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/ /vagy metakrilamid monomerekből és akrilvagy allil-típusú térhálósítószerekből (így N, N'-metilén-bisz-akrilamidból, étilén-diakrilátbó! vagy N,N'-di-allil-borkősavamidból) felépített, legalább 0,1 mekv/g (célszerűen 2— 8 mekv/g) karboxil funkciós csoportot tartalmazó polimer géleken immobilizáljuk úgy, hogy a polimer karboxil funkciós csoportjait karbodiimidekkel aktiváljuk, olyan immobilizált enzimkészítményekhez jutunk, amelyek maradéktalanul eleget tesznek a korábban felsorolt követelményeknek. Külön előnyt jelent, hogy a karbodiimides aktiválás enyhe körülmények között (0-4°C, pH=7,0) is végrehajtható, így az aktiválás sem az enzimet, sem a hordozót nem károsítja. A találmány tárgya tehát eljárás immobilizált karboxipeptidáz B enzimkészítmény előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid részegységekből és akril- vagy allil-típusú térhálósítószerből felépített, legalább O, 1 mekv/g karboxil funkciós csoportot tartalmazó polimer gélt vízben oldható vagy 0°C alatti hőmérsékleten szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyülettel aktiválunk, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban karboxipeptidáz B enzimet viszünk fel, a kapott terméket mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk vagy vizes szuszpenzióban 0-4°C-on tároljuk. A találmány szerinti eljárásban felhasználható enzimhordozókat ismert módon állíthatjuk elő a megfelelő monomerekből. Az enzimhordozókat úgy is kialakíthatjuk, hogy akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel térhálósított akrilamid- és/vagy metakrilamid-polimerből indulunk ki, amelyben a savamid-csoportok részleges hidrolízisével alakítjuk ki a karboxil funkciós csoportokat. Enzimhordozókként különösen előnyösen használhatjuk fel a Reanal Finomvegyszergyár Akrilex C kereskedelmi nevű polimerjeit. Az enzimhordozó aktiválására karbodiimid -vegyületként például N-ciklohexil-N'-(2-/4- -morfolinil/-etil) -karbodiimid-metil-p-toluol -szulfonátot vagy N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil) -karbodiimid-hidrokloridot használhatunk fel. Karbodiimid-vegyületekként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerben oldható karbodiimid-vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban csak azok a származékok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak. Az aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékü — előnyösen 6,0 és 7,0 közötti pH-értékü — oldatból visszük fel a karboxipeptidáz B enzimet. A reakció közegéül célszerűen 0,05-0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatot használunk, amelynek pH-ja 7,0. 193833 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
