193833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karboxipeptidáz-b-enzim immobilizálására
193833 A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzimkészítményt ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzimkészítményt azonban 0-4°C-on vizes szuszpenzióban is eltarthatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított immobilizált enzimkészítmények fajlagos aktivitása 600-900 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/perc/mg xerogél, ami a gyakorlati felhasználás szempontjából igen kedvezőnek tekinthető. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 3 1. példa 1 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek karboxil-tartalma 6,2±0,3 mekv/g volt, 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban (pH=7,0) szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó kevergetés közben 2 g N-ciklohexil-N’-(2-/4 - morfoliní l /-etil) -karbodiimid-metil-p-toluolszu Honát 20 ml hideg (+4°C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó keverés után a reakcióelegyhez 31 ml, 16,45 mg/ /ml koncentrációjú karboxipeptidáz B vizes oldatot adtunk, amelynek specifikus aktivitása 17 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/ /perc/mg fehérje volt. 48 óra reakcióidő után, amelyből kétszer 6 órát kevertettünk, a gélt elválasztottuk, és háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), háromszor 100 ml 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), majd háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH= =7,0) mostuk. Végül a gélt ötször 200 ml desztillált vízzel mostuk. A sómentesre mosott gélt lioíilizáltuk. Kitermelés: 1,6 g. Aktivitás: 630 pmól hippuril-L-arginin hídrólízise/perc/g szárazanyag. 2. példa 1 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek karboxil-tartalma 6,2±0,3 mekv/g volt, 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban (pH=7,0) szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó kevertetés közben 1 g N-ciklohexil-N'-(2-/4-morfolinil/-etil)-karbodiimid-metil-p-toluolszulfonát 20 ml hideg (+4°C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó kevertetés után a reakcióelegyhez 31 ml, 16,45 mg/ml koncentrációjú vizes karboxipeptidáz B oldatot adtunk, amelynek specifikus aktivitása 17 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/perc/mg fehérje volt. 48 óra reakcióidő után, amelyből kétszer 6 órát kevertettünk, a gélt elválasztottuk és háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), háromszor 100 ml 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0) majd háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0) mostuk. Végül a gélt ötször 200 ml desztillált vízzel mostuk. A sómentes mosott gélt lioíilizáltuk. Kitermelés: 1,43 g. Aktivitás: 690 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/perc/mg szárazanyag. 4 3. példa 1 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek karboxil-tartalma 6,2±0,3 mekv/g volt, 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban (pH=7,0) szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó kevertetés közben 2 g N-ciklohexil-N'-(2-/4-morfolinil/-etil)-karbodiimid-metil-p-toluolszulfonát 20 ml hideg ( + 4QC-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó kevertetés után a reakcióelegyhez 15,5 ml, 16,45 mg/ml koncentrációjú karboxipeptidáz B vizes oldatot adtunk, amelynek specifikus aktivitása 17 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/perc/mg fehérje volt. 48 óra reakcióidő után, amelyből kétszer 6 órát kevertettünk, a gélt elválasztottuk, és háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH= =7,0), háromszor 100 ml 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), majd háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0) mostuk. Végül a gélt ötször 200 ml desztillált vízzel mostuk. A sómentesre mosott gélt lioíilizáltuk. Kitermelés: 1,6 g. Aktivitás: 880 pmól hippuril-L- arginin hidrolfzíse/perc/g szárazanyag. 4. példa 1 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek karboxi-tartalma 6,2±0,3 mekv/g volt, 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban (pH=7,0) szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz jeges vízfürdőn, állandó kevertetés közben 2 g N-ciklohexil-N'-(2-/4-morfolinil/etil)- karbodiimid-metil-p - toluolszulfonát 20 ml hideg (-j-4°C-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. 10 percig tartó kevertetés után a reakcióelegyhez 62 ml, 16,45 mg/ /ml koncentrációjú vizes karboxipeptidáz B oldatot adtunk, amelynek specifikus aktivitása 17 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise/ /perc/mg fehérje volt. 48 óra reakcióidő után, amelyből kétszer 6 órát kevertettünk, a gélt elválasztottuk, és háromszor 100 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), háromszor 100 ml 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH=7,0), majd háromszor 100 ml 0. 1 mólos kálium-foszfát pufferoldattal (pH= =7,0) mostuk. Végül a gélt ötször 200 ml desztillált vízzel mostuk. A sómentesre mosott gélt lioíilizáltuk. Kitermelés: 1,55 g. Aktivitás: 740 pmól hippuril-L-arginifi hidrolízise/perc/g szárazanyag. A kapott enzimkészítmények jellemzőit az 1. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
