193806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás baktériumsejtek mechanikus úton való feltárására rekombináns technikával előállitott peptidek izolálásához
1 A találmány olyan rekombináns módszerrel előállított, savval szemben stabil polipeptidek izolálására való eljárásra vonatkozik, amelynek során a baktériumsejteket vizes savoldat, jelenlétében, 2,0—4,0 pH mellett, mechanikai úton tárjuk fel. Az EP-A-0.052.861 számú európai szabadalmi bejelentés a baktériumsejtek kémiai úton történő feltárását írja le rekombináns technikával előállított interferon, kiváltképpen IFN-a, izolálására. A szabadalmi bejelentésben az eljárást a következő lépések jellemzik: 1) A baktérium szuszpenziót — különösen E. coli szuszpenziót — amelyben a baktériumok a géntechnológiai eljárással előállított IFN-t tartalmazzák, ásványi savval pH= =2,0—2,5 értékre állítják be a baktériumok előlése céljából. 2) Az elölt baktériumokat elválasztják. 3) A kapott savanyú biomasszát egy pufferben, például írisz-(2-amino-2-hidroximetil-1,3-propándiol) és nátrium-klorid keverékében reszuszpendálják és pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítják be, s ekkor a baktériumok sejtfala elroncsolódik. 4) A baktérium sejtek elválasztása után már csak az oldatban lévő interferont kell ismert módszerekkel elválasztani és tovább tisztítani. Ismeretes továbbá, hogy a polipeptidek — ilyenek az interferonok — mechanikai behatásokkal szemben [lásd: Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 146, 249—253 (1974)] kevéssé stabilak. Ilyenfajta mechanikai behatások lépnek fel, ha a baktérium sejteket mechanikai úton roncsoljuk, a fellépő nyíróerő következtében. Ez okból máig sem volt ismert egyetlen olyan mechanikai feltárási módszer — baktérium sejtekre vonatkozóan — géntechnológiával előállított polipeptid — például interferonok — izolálása céljára, amelynek segítségével nagy kitermeléssel lehetett volna e polipeptidet izolálni. Jelen találmánynak tehát az az alapfeladata, hogy rekombináns úton előállított polipeptideknek baktérium sejtekből való izolálása céljára olyan javított extrakciós eljárást találjon, amellyel a baktérium sejtek mechanikai úton nyithatók fel. A találmány szerint e feladatot azáltal oldjuk meg, hogy valamilyen ásványi savval, ismert módszerekkel [lásd például: „Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie-Verfahren, Wirkstoffe, Prüfungsverfahren“, dr. K. H. Wallhausser, prof. dr. H. Schmidt, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967, 145—161. oldal] elöljük a rekombináns technológiával előállított polipeptidet — "például egy savakkal szemben stabil interferont — tartalmazó baktériumokat, ezután a baktériumokat elválasztjuk, majd a kapott biomasszát vizes sav-oldatban, melynek pH-ja 2,0—4,0, például egy olyan 2 2 ásványi savban, mint a hígított sósav, vagy vizes alkánsavban, mint az ecetsav vagy propionsav, reszuszpendáljuk, s ezután homogenizátor segítségével, előnyösen egy Ultra-Turrax típusú homogenizátorral, a baktériumok sejtfalát az itt fellépő nyíróerővel mechanikailag elroncsoljuk, ezt követően a kapott szuszpenziót semlegesítjük, a baktérium törmelékeket elválasztjuk, s a most már oldatban lévő polipeptidet ismert módszerekkel izoláljuk és tovább tisztítjuk. Egy rekombináns technológiával előállított, savra nem érzékeny interferon, például egy a-interferon — ilyen az IFN-a2(arg) — izolálására a találmány szerinti eljárás különösen előnyös, ha azt pH=2,5—3,5 mellett, előnyösen pH=2,5 értékű híg sósavban vagy 1%-os ecetsavban végezzük. Ezenkívül bizonyos esetekben előnyös lehet, ha homogenizálás után és a semlegesítés előtt az oldathoz valamilyen kicsapószert, például polietilén-imint adunk, 0,1—0,5% koncentrációban. A homogenizátor fordulatszáma és a baktérium sejtek feltárásához szükséges idő az adott biomassza sűrűségétől függ. Ha a biomassza sűrűsége 1,03—1,05, úgy a homogenizátor fordulatszáma célszerűen 5.000— 10.000 ford/perc. Például egy 1,04 sűrűségű biomasszánál a homogenizátor fordulatszáma célszerűen 7.000—8.000 ford/perc és a feltárás ideje 2 perc. Ha a találmány szerinti eljárás laboratóriumi méretekben történik, a legalkalmasabb készülék az IKA-Ultra-Turrax T 45, nagyobb méretek esetén a Janke-Kunkel cég (D-7813 Stauten, NSZK) Dispax-Reactor 3—3/6 készüléke ajánlható. Az Ultra-Turrax T 45 diszpergáló készülék, amelyben a magasfordulatszámú kés egy rés-koszorúval szemben forog és így a baktérium sejteket az erősen turbulens közeg szétvágja. A baktérium sejtek feltárásánál a készüléket a homogenizálandó anyagot tartalmazó főzőpohárban tartjuk, ahol az anyagot a szivattyúhatás keringteti. Ez esetben a fordulatszám körülbelül 5.000—10.000 ford/ /perc és a feltárási idő 1 —10 perc között van. Ezzel szemben a Dispax-Reactor 3—3/6 egy háromlépcsős kényszerpályás Ultra-Turrax, azaz itt minden baktérium sejtnek azonos átfolyási sebességgel kell a homogenizáló kamrán átvándorolnia. Ilyen módon egyenletesen feltáródott baktérium homogenizátumot kapunk. A Dispax Reactor-ban a fordulatszám 3.000—8.000 ford/perc és a kifolyásnál a folyadék nyomása maximum 200 kPa (2 bar). Ezzel a homogenizátorral 1 —10 perc alatt 50 liter biomassza homogenizálható. Az 1. ábrán a Dispax-Reactor 3—3/6 típusú homogenizátor keresztmetszetét mutatjuk be. Az ábrán F-el jelöljük a homogenizálandó anyag beadagolására szolgáló kamrát, E-vel jelöljük, a H hajtóműben lévő csúszógyürűs tömítést, G-vel jelöljük 193806 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
