193806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás baktériumsejtek mechanikus úton való feltárására rekombináns technikával előállitott peptidek izolálásához
193806 4 a hajtótengely főcsapágyát. A H hajtótengelyen egymásután három hengeralakú (C) rotor helyezkedik el, amelyek a megfelelően kiképzett státorokba nyúlnak be. A státorok a homogenizátor-ház belső falához vannak erősítve, A H hajtótengely végére van erősítve a B szállítócsiga, amely az A kifolyónyílásba nyúlik be. A státorok hűtésére szolgál a státorokat körülvevő hűtőkamra. A kamra hűtővízzel való ellátását szolgálja az L bevezető és K kivezető nyílás. A főcsapágyon lévő csúszógyűrűs tömítés hűtővízzel való ellátása a J víz-bevezető nyíláson történik, előnyösen megemelt — például 150 kPa (1,5 bar) — nyomás alatt. A hengeralakú rotorok kiképzése lehet kettősdob alakú, vagy hármas-, illetve többszörösdob alakú, s a dobok fala benyúlik a státorokon lévő közti tereknek megfelelő dobfalak közé. A homogenizálandó folyadék, amelyet a B csiga hajt be, átmegy a rotorok és státorok közti téren, ahol a rotorok gyors forgása következtében fellépő nyíróerő a baktériumok falát elroncsolja, majd a homogenizált anyag az A kifolyón hagyja el a homogenizátort. Elvileg ez az eljárás más ismert mechanikus sejt feltáró módszerekkel is keresztülvihető, ahogy ez például a Biochemical Engineering [Academic Press (1973); második kiadás] 358. oldalán megtalálható. Azonban a kitermelés ekkor alacsonyabb. Míg ha a találmány szerinti eljárásban az Ultra-Turrax T 45 vagy a Dispax-Reactor 3—3/6 készüléket használjuk, nagyobb kitermelést kapunk, például interferon esetében — a beadagolt biomasszára vonatkoztatva — mint az eddig ismert eljárásokkal, ami a technika fent ismertetett állása alapján nem volt előre látható. A következő példákkal közelebbről világítjuk meg a találmányt, anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét e példákra korlátoznánk. 1. példa Egy E. coli HB 101/pER33 klón (lásd az EP-A-0.115.613 számú európai szabadalmi bejelentést) baktérium szuszpenziójának — amelyben a baktériumok humán alfa2-interferont tartalmaznak — pH-ját ásványi savakkal 2,0—2,5 közé állítjuk be a baktériumok elölése céljából. Az elölt baktérium sejteket a szuszpenzióból elválasztjuk és —20°C-ra lefagyasztjuk. Az A gyártási tételből 20 kg mélyfagyasztott biomasszát 250 liter 1%-os ecetsavban, 8°C-on feliszapolunk. Amikor a biomassza teljesen felolvadt, háromlépcsős homogeriizátorban (Dispax-Reactor 3—3/6) diszpergáljuk. A finoman diszpergált lizátumhoz kicsapási segédanyagként 0,1%-os polietilén-imint adunk, majd a pH-értékét 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,5-re emeljük. Két órás extrahálási idő után a kilúgozott biomasszát szeparátorban (Westfália) választjuk el, 1,5 1/perc átfolyási sebesség mellett. A’tiszta 3 folyadékból próbákat veszünk és meghatározzuk interferon és protein tartalmukat. Kitermelés: 46.9X101 * * * * 6 NE/g biomassza (NE= =nemzetközi egység). Hogy a homogenizátor befolyását az interferon kitermelésre meg tudjuk Ítélni, a feliszapolt biomasszából 500 ml-t kiveszünk a diszpergálás előtt és a homogenizálási lépés nélkül, az EP-A-0.052.861 számú európai szabadalmi bejelentés szerinti eljárással extraháljuk. A pH értéket 3 n nátrium-hidroxid-oldattal emeljük 7,3-ra. Egy órás extrakciós idő után a kilúgozott biomassza lizátumát laborátóriumi centrifugában derítjük. A felülúszóból, mint fent, próbákat veszünk hogy interferon és protein tartalmukat meghatározzuk. Az EP-A-0.052.861 számú európai szabadalmi bejelentés szerinti kitermelés: 25,3X XlO6 NE/g biomassza. 2. példa A B gyártási tétel biomasszájából az 1. példában leírtakkal azonos módon állítunk elő anyagot. Kitermelés: 21,3X106 NE/g biomassza. Az EP-A-0.052.861 szerinti kitermelés: 9,7X106 NE/g biomassza. 3. példa A C gyártási tétel biomasszájából az 1. példában leírtakkal azonos módon állítunk elő anyagot. Kitermelés: 13,8X10® NE/g biomassza. Az EP-A-0.052—862 szerinti kitermelés 5,1X10® NE/g biomassza. 4. példa 1.000 g biomasszát — melyet az 1. példában leírtakkal azonos módon állítunk elő — úgy dolgozunk fel, hogy 10.000 ml hígított sósavban (pH=2,5; 4 ml 37%-os sósav 10.000 ml-re feltöltve vízzel) vesszük fel és IKA-Ultra-Turrax T 45-el diszpergáljuk. Kitermelés: 50X10® NE/g biomassza. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás baktérium sejtekből rekombináns módszerrel előállított, savval szemben stabil polipeptidek, előnyösen interferon izolálására , azzal jellemezve, hogy a baktérium sejteket, amelyek a géntechnológiával előállított, savval szemben stabil polipeptidet, előnyösen interferont tartalmazzák, valamely sav vizes oldatában — pH=2,0—4,0 közöti — mechanikai úton elroncsoljuk és ezután a már szuszpenzióban lévő polipeptidet, előnyösen interferont ismert módszerekkel elválasztjuk és tovább tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás,azzal jellemezve, hogy rekombináns módszerrel előállított, savakkal szemben stabil interferon tartalmú baktérium sejteket dolgozunk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
