193791. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-helyettesített-1,3-propilidén-difoszfonát származékok és gyógyászati készítmények előállítására
193791 csíkot azonnal belemerítjük 50 ml Krebs-Ringer oldatba, és az oldaton folyamatosan 95:5 arányú oxigén-szén-dioxid elegyet buborékoltatunk át. A fürdő hőmérsékletét 37 ± 1°C értéken tartjuk. A Nghiem által módosított Krebs- Ringer oldat összetétele a következő: 118,0 mmól/1 nátrium-klorid, 4,7 mmól/1 kálium-klorid, 2,5 mmól/1 kalcium-klorid, 1,8 mmól/ /I magnézium-klorid, 12,5 mmól/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 1,18 mmól/1 kálium-díhidrogén-foszfát, 5,5 mmól/1 glükóz. Az oldat készítéséhez kétszer desztillált vizet használunk. Az oldat pH-ja 7,4. Minden csíkot 1,5- -2,0 g kezdeti terhelés mellett 1-2 órán át ekvilibrálunk, a fürdő oldatát 30 percenként kicseréljük. A kiváltott összehúzódást, illetve relaxációt izometriásan mérjük Ugo-Bastile-féle, erő okozta elmozdulást érzékelő transzduktorral és az értékeket Beckman írószerkezettel regisztráljuk. b) Az 1,3-difoszfonát-származékok relaxáló hatása Equilibrálás után a fürdőbe 65 mmól/1 végtérfogat eléréséig kálium-kloridot adagolunk. Ez a koncentráció váltja ki a légcső legnagyobb összehúzódását. Ilyen körülmények között a tónusos tartós összehúzódásban megnyilvánuló plató fázist 30 perc alatt érjük el. A plató fázis elérése után 30 perccel adagoljuk a fürdőbe a gyógyszereket. A beadagolt gyógyszer végkoncentrációja 1,0 pmól/I, a gyógyszeroldat térfogata nem haladja meg a 100 pl-t. A légcsőösszehúzódásnak á gyógyszer hatásával kapott értékét a gyógyszernek a fürdőbe történt beadagolása után 40 perc múlva regisztráljuk. Maximális kálium-kloridra adott válasznak (100%) a kezdeti, káiium-klorid által kiváltott összehúzódást tekintjük. A vizsgálatok eredményét a maximális összehúzódás %-ában kifejezve adjuk meg. Referencia anyagokként a vizsgálat során Nifedipinet, Prenylaminet, Flunarizinet és Diltiazemet használtunk. c. ) A vizsgált vegyületeket és gyógyszereket 0,9%-os nátrium-kloridban oldottuk, kivéve a vízben nem oldódóakat. Ez utóbbiakat 2%-os etanolban oldottuk. Az etanol végkoncentrációja a vizsgálandó mintában olyan értékű, amely a vizsgálatot nem zavarja. d. ) Statisztikus elemzés Az eredményeket átlagérték ± SEM formájában adjuk meg, és a Student t-teszttel végzünk statisztikai elemzést. Azokat a vegyületeket tekintjük hatásosnak, amelyek a káiium-klorid által kiváltott maximális összehúzódást (100%) legalább 95%-ra csökkentik. e. ) Eredményeink alapján a 25., 37:, 55., 73., 40., 74., 75., 79., 83., 38., 87., 88 és 117. számú vegyületeket találjuk farmakológiailag aktívnak. Ezek az eredmények alátámasztják annak lehetőségét, hogy az 1,3-difoszfonátszármazékok simaizom relaxáns gyógyszerként, például asztma kezelésében, kerüljenek 53 28 felhasználásra. Az eredményeket a 3. táblázatban ismertetjük. 3. Táblázat 1,3-difoszfonát-származékok gátló hatása patkány légcső kálium-kloriddal kiváltott összehúzódására 54 Vegyület száma összehúzódás (max.% ) 10. 91,0±0,0 25. 53,0±2,5 30. 90,0±0,0 37. 53,8 ±0,4 38. 84,0±2,4 40. 61,2±4,6 39. 96,0±4,9 55. 73,0± 1,0 56. 100,0±0,0 73. 46,2 ±1,8 74. 35,0 ±1,2 75. 70,0 ±3,0 111. 100,15 ± 1,5 79. 60,3±9,6 83. 62,5 ±11,5 82. 80,0±4,0 84. 98,5±2,5 86. 89,0±2,0 85. 96,2±0,8 87. 71,9 ±1,9 66. 88,5±0,5 88. 56,3±5,9 68. 100,0±4,0 112. 84,0±3,0 113. 90,0 ±1,5 117. 60,0 ±4,0 C. 1,3-Difoszfonát-származékok hatása patkány izolált szívpitvarának ritmusára Okamoto-Aoki törzsbe tartozó spontán magasvérnyomású patkányokat (SHR) pentobarbitállal (Nembutal, az Abbot Co. terméke, alkalmazott mennyiség 60 mg/kg i.p.) anesztetizálunk. Az állatok szívét gyorsan kimetszük, mindkét pitvart megszabadítjuk a hozzájuk tapadó szívszövetektől. A pitvarokat azonnal 50 ml Krebs-Ringer Jürdőbe helyezzük. A Krebs-Ringer fürdő összetétele a következő: 120,0 mmól/1 nátrium-klorid, 5,63 mmól/1 káiium-klorid, 2,0 mmól/1 kalcium-klorid, 2,10 mmól/1 magnézium-klorid, 25 mmól/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 9,7 mmól/1 glükóz; az oldat pH-ja 7,4, hőmérséklete 37±1°C. Az oldaton folyamatosan 95:5 arányú oxigén-szén-dioxid elegyet buborékoltatunk át. A pitvart optikai elven működő, elmozdulást érzékelő transzduktorhoz rögzítjük (IITC, USA), a nyugalmi terhelés 1 g. Ily módon mérjük a pitvar ritmusát. A készítményt 40 percig ekvilibráljuk, majd 0,5- -5 pmól/1 koncentrációknál meghatározzuk az egyes vegyületekre a kumulatív dózis-hatás görbéket. A maximális hatást minden vizsgált koncentráció esetén 30-40 percen belül kapjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 <?o 65
