193791. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-helyettesített-1,3-propilidén-difoszfonát származékok és gyógyászati készítmények előállítására
193791 A. Az 1,3-difoszfonát-származékok moduláló hatása [3H]-Nitrendipinenek agy-membránhoz való kötődésére a) Anyagok [3H]-Nitrendipine (70 Ci/mmól, 1 Ci= =3,7-10'° Bq), Flunarizine, Prenylamine-laktát, Nifedipine, TMB-8 és Verapamil, valamennyi a kereskedelmi forgalomból származó; valamint Diltiazem-hidrogén-klorid, amelyhez/ a Goedecke A. G. ajándékaként jutottunk. A vízben oldhatatlan anyagokból abszolút alkoholban készítettük 10 mmól/l-es és 2,5 mmól/l-es törzsoldatokat. A törzsoldatokból a megfelelő hígításokat 150 mmól/1 nátrium-klorid- és 1 mmól/1 kalcium-klorid-tartalmú pH=7,4-es, 50 mmól/l-es trisz-HCl pufferben készítjük. A vizsgálatnál az etanol koncentrációja egy esetben sem haladta meg a 0,1%-ot. A radioaktív kötődő anyag és az egyéb reagensek tisztaságát szilikagél lemezen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal ellenőriztük. b.) Módszerek A következő módszert Belleman és mtsai [Proc. Nat. Acad. Sei., 80, 2356 (1983)] és Gould és mtsai [Proc. Nht. Acad. Sei., 79, 3656 (1982)] eljárásaiból adaptáltuk. 250-300 g tömegű felnőtt Wistar patkányokat szén-dioxiddal anesztetizálunk, majd dekapitálunk. Az állatok eltávolított agyát 0,32 mól/1 -es jéghideg szacharózba merítjük, majd 2-3-szor friss oldattal mossuk. Az agykérget felaprítjuk, majd Potter-Elvehjem homogenizáló készüléken tízszeres térfogatú jéghideg szacharózoldatban homogenizáljuk. A homogenizátumot 4°C-on, 1000 g értéken 15 percig centrifugáljuk. A kapott felüldszót 30 percig 90000xg értéken centrifugáljuk, és a kiülepedett anyagot 20 ml jéghideg, 50 mmól/les, pH=7,4 -es trisz-HCl pufferrel kétszer mossuk. Ezután a szilárd anyagot 150 mmól/1 nátrium-kloridot és 1 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó 50 mmól/l-es, pH=7,4-es trisz-HC1 pufferben 4 mg/ml fehérje koncentrációra szuszpendáljuk. A membránszuszpenziót felhasználásig jégen tartjuk. A kötődési vizsgálatokat a dihidropiridin lebomlás megakadályozására félhomályban végezzük. 150 mmól/1 nátriüm-kloridot és 1 mmól/1 kalcium kloridot tartalmazó pH=7,4-es 50 mmól/l-es trisz-HCl pufferben lévő, csövenként 400 pg membránfehérjét és a megjelölt mennyiségű radioligandumot és vizsgálandó vegyületet, illetve ismert kalcium-antagonistát tartalmazó elegyet inkubálunk. Az elegy össztérfogata csövenként 2 ml. A megjelölt időtartam elteltével az elegyet gyorsan átszűrjük Millipore szűrő hordozóra vitt Whatman GF/B üvegszál szűrőn (2,4 cm átmérőjű szűrő). Ezzel a reakciót megszakítjuk. A vizsgálati anyagot tartalmazó csövet 2 ml jéghideg, pH=7,4-es, 50 mmól/les trisz-HCl pufferrel átöblítjük, és ugyan- 24 45 ebből a pufferből még kétszer 5 ml mennyiséggel átmossuk a csapadékot. A szűrőket hősugárzó lámpa alatt szárítjuk, majd folyékony szcintillációs eleggyel extraháljuk és meghatározzuk a tricium menynyiségét. Szcintillációs elegyként 4 g/1 Omnifluor tartalmú 2:1 arányú toluol-triton X-100 elegyet alkalmazunk. A tricium meghatározásánál a számlálás hatásfoka 48%. A nem-fajlagos kötődést 1,0 pmól/1 jelzetlen Nifedipine jelenlétében határozzuk meg és ezt az értéket a teljes kötődésre kapott eredményből levonva kapjuk a „fajlagos kötődési" értéket. A vizsgálatokat két vagy három párhuzamos méréssel végeztük. Eredményeinket százalékos értékben kifejezve adjuk meg, a fajlagos [3H]-Nitrendipine kötődést a kontrolihoz hasonlítva. A vizsgált vegyületek [3H]-Nitrendipine kötődésre kifejtett aktivitását a következő szempontok figyelembevételével értékeltük: 1) A vizsgált vegyületet 1,0 pmól/1 végkoncentrációban alkalmazva a [3H] -Nitrendipine-kötés a vizsgált vegyület adagolása nélkül kapott kontrolihoz viszonyítva 95% alatti vagy 105% feletti értékű. 2) Az 1,0 pmól/1 vegyület alkalmazásával kapott fajlagos [%]-Nitrendipine kötés értéket a 0,1 pmól/1 vegyület alkalmazásával kapott hasonló értékkel elosztva az arány minden esetben kisebb 0,9-nél vagy nagyobb 1,1-nél. Ha ez az arány észrevehetően eltér 1,0-től, azt jelzi, hogy a vizsgált koncentrációtartományon belül fennáll a dózis-hatás kapcsolat. Megjegyezzük, hogy egyes vizsgálatokban [3H] -Nitrendipine helyett egy új, kereskedelmi forgalomban beszerezhető fajlagos dihidropiridint (a [3H]-PN200 110-t) alkalmaztunk. Az eredmények hasonlóak a [3H]-Nitrendipinnel kapottakhoz. c) Eredmények A fajlagosan kötött [3H]-Nitrendipine mennyiségének meghatározásánál referencia kontrollként ismert kalciumantagonistákat használtunk. Ezek alkalmazásával a következő %-os [3H]-Nitrendipine kötés értékeket nyertük: TMB-8 95%, Flunarizine 55%, Prenylamine 5%, Verapamil 44%, Nifedipine 0%. A 2a táblázatban jól látható, hogy a vizsgált 1,3-difoszfonát-származékok között a [3H]-Nitrendipine kötésre ható erős inhibitorok (38., 79., 66., 88., 68., 113., 117., 83., 73. és 75. számú vegyület) és aktivátorok (55. és 56 számú vegyület) is vannak. A fajlagosabb dihidropiridint, a [áH]-PN200 110-t alkalmazva hasonló eredményeket kapunk a 79. vegyületet belső standardként alkalmazva, és néhány a Nifedipinehez hasonlóan aktív vegyületet találtunk, ezek a 90., 93., 92., 89. és 106. számú vegyületek. Megjegyezzük, hogy még számos 1,3-difoszfonát-származék mutat nagyobb aktivitást, mint az előzőekben referenciavegyületként ismertetett ismert kalcium-46 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
