193744. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás l-karnitin előállítására
193744 1 A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás L-karnitin előállítására. Ismert az L-karnítín gamma-butiro-betainból való előállítása, amelynek során a gamma-butiro-betaint nátrium-2-oxo-glu tarát, redukáló anyagok, vasion-forrás és hidroxilcsoport-forrásként szolgáló oxigén jelenlétében a Neurospora crassa mikroorganizmusból felszabadított hidroxiláz enzimmel kezelik (4 371 618 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az eljárás hátránya, hogy számos járulékos tényezőt (kofaktor) igényel: így a reakció során stöchiometrikus mennyiségű 2-oxo-glutarát oxidáció útján szukcináttá dekarboxileződik, az oxigén aktiválásához kétvegyértékű vasionok kellenek, továbbá aszkorbát, hogy a vasionok redukált állapotban maradjanak, és végül kataláz a nyomokban keletkező káros hidrogén-peroxid lebontására. Lindstedt et al. (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) „The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas") Pseudomonas nembeli mikroorganizmust izoláltak, amely C- és N-forrásként gamma-butiro-betaint képes hasznosítani. A lebontás első lépcsőjében a gamma-butiro-betain L-karnitinná hidroxileződik, de az intermedierként keletkező L-karnitin a metabolizálás során teljesen lebomlik szén-dioxid, víz és ammónia végtermékre. Az ebből a mikroorganizmusból nyert hidroxiláz—ha az L-karnitin előállításához hasznosítanák—járulékos tényezők szempontjából a fenti hátrányokkal járna (Lindstedt et al., Biochemistry 16, 2181-2188 (1977), „Purification and Properties of y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK I"). A találmány célja olyan új típusú mikroorganizmus biztosítása volt, amellyel az ismert eljárások hátrányai kiküszöbölhetők és egyszerű módon nem a racém karnitin, hanem enantio-szelektív módon L-karnitin állítható elő krotono-betaninból, butiro-betainból vagy a kettő keverékéből. A technika állásából ismert rendszerekkel ellentétben a találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok nem oxigént, hanem vizet alkalmaznak hidroxilcsoport-forrásként, ahogy H2isO és ,s02 jelzett vegyszerekkel végzett saját kísérletek mutatták. A találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok krotono-betainból és/vagy gamma-butiro-betainból L-karnitint termelnek, de az utóbbit nem katabolizálják. Ahogy négy kontinensen szedett talajminták összehasonlító vizsgálata kimutatta, a butiro-betaint és krotono-betaint L-karnitinen keresztül katabolizáló mikroorganizmusok mindenütt jelen vannak; szennyvíztisztító berendezések feles eleveniszapjából is sikerül az elkülönítés. Ezek a törzsek potenciálisan mind alkalmasak az L-karnitin termelésére, ha a találmány szerinti elv alapján mutagenizáljuk őket. Alkalmas mutánsokat úgy állíthatunk elő, hogy 2 2 a) C- és N-forrásként betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint hasznosítani képes mikroorganizmusokat a szokásos módon mutagenizáljuk, és b) a tenyésztés során kapott mutált kultúrából azokat a mikroorganizmusokat izoláljuk, amelyek stabilisak, L-karnitint nem katabolizálják, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen. A b) szelekciós lépést követően előnyösen azokat a mikroorganizmusokat választjuk ki, amelyek az L-karnitint kiválasztják, és L-karnitint, krotono-betaint, gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen. A mutált mikroorganizmusokat célszerűen betain-tartalmú közegen kultiváljuk tovább, majd a b) lépés végrehajtására előnyösen L-karnitin-tartalmú közegen tenyésztjük tovább. A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes törzseket célszerűen úgy tenyésztjük, hogy baktérium keverékeket krotono-betaint tartalmazó tápoldattal oltva keverék kultúrát hozunk létre és a keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével krotono-betaint lebontani képes mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyerjük. A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes tenyészet mutációját ismert módszerekkel érhetjük el (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Stabil mutánsok előállítására alkalmas a Frame-Shift-módszer, a deletálás módszere, valamint a transzpozon-inzertálás módszere. A mutált mikroorganizmusokat—betain-tartalmú közegben végzett tenyésztés, majd L'-karnitint tartalmazó közegre történő átoltás után—a b) szelekciós lépésnek vetjük alá, amelyben ismert „counter-szelektáló ágensek" segítségével (P. Gerhardt et al. (eds.), Manual of Methods of General Bacteriology, Am. Soc. for Microbiology, 1981) az L-karnitint nem katabolizáló, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem hasznosító, de betaint hasznosító mikroorganizmusokat szelektáljuk. A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosító mikroorganizmusok közül a 2938 szám alatt a Német Mikroorganizmus-Gyűjteményben (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, 4300 Göttingen, Griesebachstr. 8., NSZK) 1984. március 3-án letétbe helyezett, HK 4 jelű törzset, valamint deszcendenseit és mutánsait részesítjük előnyben. (A mikroorganizmus tudományos leírása lásd I. táblázat.) A HK 4 jelű mikroorganizmusból mutáció és szelektálás révén előállítottuk a HK 13 5 10 16 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
