193696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új SB 22484 antibiotikum-komplex előállítására
193696 előnyösen az ún. sztérikus kizárásos kromatográfiás technikát alkalmazzuk optimális elválasztási eredmények elérésére. Közelebbről: kivételesen használható stacionárius fázisnak bizonyul — és kiváló tisztítás elérését biztosítja — a Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) , egy ellenőrzött pórusméretű keresztkötéses dextrán, amelyben a legtöbb hidroxilcsoport alkilezett. Egy másik megoldás szerint a szűrt fermentlevet pH 5-9-re állítjuk be és egy funkcionálisan nem módosított polisztirol gyantát így Amberlite X-AD-2 (vagy X-AD-4, X-AD-7, X-AD-8) vagy Diaion HP 20 gyantát — tartalmazó, ionmentesített vízzel elkészített kromatográfiás oszlopon vezetjük át, eluálószerként biner —10— 90%-os vizes aceton, metanol, etanol, n-propanol, izopropanol vagy tetrahidrofurán elegyet alkalmazva. A frakciókat az antibiotikum-tartalomnak megfelelően összeöntjük, szárazra pároljuk, a pH-t 4-8-ra állítjuk be és extraháljuk, ahogyan ezt a szűrt fermentlével kapcsolatban az előbbiekben leírtuk. Egy másik kitüntetett eljárás szerint a szűrt fermentlé pH-ját kb. 7,5-re állítjuk be és valamely vízzel nem elegyedő rövidszénláncú alkil-alkanoil-észterrel, előnyösen butil-acetáttal extraháljuk. A szerves réteget betöményítjük és pH-ját kb. 9,0-ra állítjuk be. Ezt a pH-beállítást előnyösen nátrium-dietil-malonát adagolásával érjük el. A csapadékot vízzel felvesszük, pH-ját kb. 4-re állítjuk be és ismét extraháljuk a kiválasztott, vízzel nem elegyedő rövidszénláncú alkil-alkanoil-észterrel. A pH kb. 9-re való beállításával — egy bázis, előnyösen nátrium-dietil-malonát hozzáadásával — megismételjük a kicsapást, így egy tisztított készítményt állítunk elő, amely a találmány szerinti antibiotikumot tartalmazza. Ehhez a tisztításhoz más oszlop-kromatográfiás technikák, így adszorpciós kromatográfia vagy megosztásos kromatográfia is alkalmazható. A sóképzéssel való tisztítást egyszerűen úgy végezzük, hogy az antibiotikumot megfelelő oldószerben oldjuk és ekvimolekuláris mennyiségű bázist adagolunk. A képződött sót egy, azt nem oldó kicsapószer hozzáadásával kicsapjuk, majd szűréssel kinyerjük. A szabad sav alakú antibiotikumot úgy állítjuk elő, hogy a nyers antibiotikumot etil-acetátban oldjuk és a szerves oldatot savas pufferrel —előnyösen foszfát-pufferrel — kb. pH 4,0- -n extraháljuk. A termék kinyerését ezután lényegében a szokásos eljárások alkalmazásával végezzük, pl. a szerves, rétegből való kicsapással vagy a keverék kis térfogatra való betöményítésével. Ha a termék hatóértéke nem eléggé magas, tovább tisztíthatjuk oszlop-kromatográfiává 1, lényegében ugyanazon eljárás szerint, amelyet az előbbiekben az első tisztítással kapcsolatban leírtunk. Ha a tisztításhoz oszlop-kromatográfiát alkalmazunk, a teljes tisztítási eljárást HPLC-vel is követhetjük. 7 A hasonló HPLC profilú frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. így lényegében tiszta SB 22484 antibiotikumot kapunk. Az SB 22484 antibiotikum fiziokémiai jellemzői Az SB 22484 antibiotikum a következő tulajdonságokkal rendelkezik: A) UV-abszorpciós spektrum, az 1. ábra szerint, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja: Iarnbdamax(nm) Eí\m a) 0,1N HCl-ban 230 663 283 192 332 343 b) pH 7,38 foszfát-pufferben 230 719 323 391 c) 0,1N nátrium-hidroxidban 323 387 d) metanolban 229 715 320 165 B) IR abszorpciós spektrum a 2. ábra szerint, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm-1) : 3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215;1145; 1090; 1060;1035;990; 945;910; 890; 850; 810; 720 (nujol) C) NMR spektrum a 3. ábra szerint, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) hexadeuteroacetonban (270 MHz, 'H-NMR), belső standardként TMS-t használva (0,00 ppm); 0,77 (3H), 0,83(3H), 1,21 -1,24(3H), 1,2- -2,7(5H), 1,67(s, 3H), 1,73 (3H), 2,01 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 3,3-5,6 (11H), 5,4-6,7 (13H), 6,04 (1H), 7,40 (1H), 7,68 (1H), 10,53 (1H) (s= szingulett) D) Tömegspektrum, amelyet LC-MS módszerrel (közvetlen folyadék-bevezetéses folyadék-kromatográfiás tömeg-spektroszkópia) vettünk fel, HP 5985B készülék alkalmazásával, negatív ionos üzemmódban, az LC-t a következő feltételek mellett végezve: oszlop: Brownlee Lab. RP RP 8-10 pm, 25 cm, áramlási sebesség: 1 ml/perc, eluálószer: 60:40 acetonitril: 0,1M ammónium-formiát. A spektrum 4 főbb csúcsot mutat, amelyek retenciós ideje 4,48, 5,03, 5,65 ill. 7,25 perc és amelyeket feltételesen SB 22484 antibiotikum 1., 2., 3. és 4. faktornak nevezünk. A főbb fragmentációs csúcsok az előbbi antibiotikum faktorok — azaz az SB 22494 antibiotikum 1., 2., 3. és 4. faktor — vonatkozásában a következők: 1. faktor: 752, 734, 716, 684, 538, 598, 566, 500 2. faktor: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 3. faktor: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 4. faktor: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
