193579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leucin-származék és az ebből képzett gyógyszerkészítmény előállítására
193579 Optikai forgatóképesség: [a]»° = —19,0°" (c=I, kloroform). Tömegspektrum (kémiai ionizálás, ammónia reagens-gázzal): csúcsok többek között m/z 509 (M + NH,+) és 492 (M+H+) értéknél. IR spektrum: sávok többek között 3318, 3012, 2928, 2558, 2745, 1823, 1740, 1673, 1521, 1382, 1370, 1250, 1191 cm-1 értéknél. A lipsztatin kémiai lebontásával és a kapott részegységek ismert anyagokkal történő öszszehasonlításával igazoljuk az abszolút konfigurációt. B/ Lipsztatin előállítása (1. variáns) a) Fermentáció Az 1. példa szerint előállított Streptomyces toxytricini előtenyészettel (rázólombikban, majd 10 literes Fermentorban végzett fermentáció) 200 literes fermentorban levő N 16 termelő tápközeget beoltunk. Az N 16 termelő tápközeg az 1. példában ismertetett N 7 termelő tápközeggel azonos, azonban 0,1% sertészsírt is tartalmaz. A fermentációt az 1. példa szerint 120 órán át végezzük. Az intracelluláris lipázgátló aktivitás 120 óra elteltével 71 IC50/ml, míg az extracelluláris aktivitás 4 IC50/m) fermentlé. b) Feldolgozás A fermentáció befejezése után a fermentlevet 10 percen át 80°C-on melegítjük, majd lehűtjük és a sejtmasszát ce: trifugacsövekben történő centrifugálással elválasztjuk. Kétszeri centrifugálás után 11,4 kg micéliumot kapunk; a fermentlé szűrletét elöntjük. A micéliumot 70 liter metanollal 30 percen át keverjük, majd a kapott szuszpenziót szűrjük. A szürőlepényt 50 liter metanollal továbkeverjük és szűrjük. Az egyesített metanolos extraktumokat 1,8 literre bepároljuk. A koncentrátumot háromszor 2 liter butil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumok bepárlása után 160 g nyers extraktumot nyerünk. c) Tisztítás A kapott nyers extraktumot 5:4:0,9 arányú hexán-metanol-víz rendszerrel történő többszörös extrakcióval tisztítjuk. Először az alsó fázis aktív anyagát a felső fázisba átvisszük. 160 g nyers extraktumot 4 liter alsó fázisban oldunk, és kikeverő edényben 14 liter felső fázissal keverünk. A felső fázis elválasztása után az alsó fázist 4 liter, friss felső fázissal másodszor is extraháljuk. A képződő stabil emulzióhoz további 4 liter alsó fázist és 4 liter felső fázist adunk; ekkor a fázisok jól szétválnak. A felső fázis elválasztása után az alsó fázist kétszer 8 liter friss felső fázissal extraháljuk. Az egyesített felső fázisok bepárlása után 90,3 g extraktumot kapunk. Az extrahált alsó fázist elöntjük. Ezután az aktív anyagot a felső fázisból az alsó fázisba viszszük át. 90,3 g fenti extraktumot 4 liter felső fázist friss, alsó fázissal háromszor extra extrahálunk. A fázisok szétválasztása után a felső fázist friss alsó fázissal háromszor extraháljuk. A felső fázist elöntjük. Az egyesített alsó fázisokat 0,7 liter vizes fázisra bepárol7 juk, és a sűrítményt nyolcszor, összesen 0,2 liter etil-acetáttal extratráljuk. Az extraktum bepárlása után 25,8 g terméket kapunk. Az extrahált vizes fázist elöntjük. A kapott anyagot a továbbiakban 1 kg kovasavgél 60-n történő átszűréssel (szemcsenagyság 0,040—0,063 mm, oszlop 10x100 cm) és kloroformos eluálássa! tisztítjuk? 649 mg terméket kapunk, amelyet Lobar-készoszlopon (Lichoprep RP-8, C nagyság) történő kromatográfálással és metanolos eluálással tisztítunk (fordított fázisú kromatografálás) 204 mg vékonyréteg-kromatografiásan tiszta lipsztatint kapunk. C/ Tetrahidro-lipsztatin előállítása 138 mg lipsztatint 10 ml etanolban oldunk, majd 60 mg 5%-os palládium-szén katalizátort adunk hozzá és szobahőmérsékleten hidrogén-atmoszférában (ballon) 3 órán át keverjük. A katalizátort centrifugálással elválasztjuk. A hidrogénezett terméket rövid kovasavgél-oszlopon (1x5 cm) kloroformmal kromatografáljuk és kloroformmal eluáljuk. Viaszszerű gyengénsárga, szilárd anyag alakjában 112 mg (2S,3S,5S)-5-[(S)-2-formamido-4-metil-valeril-oxi] -2-hexil-3-hidroxi-hexadekánsav-laktont (tetrahidrolipsztatin) kapunk. Optikai forgatóképesség: [a]^° = —32° (c = 1, kloroform). Tömegspektrum: (kémiai ionizálás NH3 reagens-gázzal): csúcsok többek között m/z 513 (M + NH4+); 496 (M+H+) és 452 (M-f-H+ —C02) értéknél. IR spektrum (film) : sávok többek között 3332, 2956, 2921, 2953, 1838, 1731, 1709, 1680, 1665, 1524, 1383, 1249 és 1200 cm-1 értéknél. 'H NMR-spektrum (270 MHz, CDCU: 0,89 (6H); 0,97 (6H); 1,15—1,5 (27H); 1,5—1,85 (6H); 1,9—2,25 (2H); 3,24 (1H); 4,32 (1H); 4,68 (1H); 5,03 (1H); 6,43 (1H); 8,02 és 8,21 (1H) ppm. D/ Lipsztatin előállítása (2. variáns) a) Fermentáció 2 literes rázólombikban levő 391 sz. tápközeget a Streptomyces toxytricini 85—13 ferde-agar-tenyészet spóráival beoltunk és 72 órán át, 28°C-on, aerob körülmények között inkubálunk. Ezután 2 liter előtenyészetet 50 literes fermentorban levő N 16 termelő tápközegbe viszünk át, és 77 órán át, 0,5 téri./ /té~f. levegő levegőztetés mellett, 28°C-on inkubáljuk. A kapott 50 liter előtenyészetet 1000 literes fermentorban levő N 16 tápközeg beoltására használjuk fel. A termelő fermentác:ót 28°C-on 0,5 térf./térf. levegő levegőztetés mellett 91 órán át végezzük. Az intracelluláris lipsztatin-titer ekkor 73 IC50/ml, míg az extracelluláris érték 16 lC50/ml. A teljes fermentlevet 2°C-ra hűtjük és centrifugáljuk. 41 kg nedves biomasszát nyerünk, amelyet —20°C-on szárítunk. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
