193548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy hatékonyságú és nagytisztaságú aminoglükozid antibiotikumok előállítására
193548 ben sóik formájában, amely abban áll, hogy a fenti antibiotikumok elegyét először hidroxil formájú, finom szemcsés, erősen bázikus anioncserélő gyantán kromatografáljuk eluálószerként ionmentes vizet alkalmazva, s az így kapott frakciók közül a a) gentoximicin A-t, gentoximicin B-t és sziszomicint tartalmazó — viszonylagosan apoláris-antibiotikum elegyet finomszemcsés, karboxil típusú kationcserélő gyantán és/vagy karboximetil- vagy szulfonsav-csoportokat tartalmazó dextrángélen történő kromatográfiával, illékony ammónium-bázisok híg vizes oldataival — adott esetben 5—10% rövidszénláncú alkanol jelenlétében — végzett szelektív leoldás segítségével, míg b) a gentamicin B-t és B,-t tartalmazó poláris antibiotikum elegyet, amely gentoximicin és sziszomicin mentes állapotban tartalmazza a fenti komponenseket, önmagában ismert módon, alkotó részeikre választjuk szét, s a szétválasztott antibiotikumokat — kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható savakkal képzett sók formájában — elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy valamely gentamicin B-t, Bret, sziszomicint, valamint gentoximicin A-t, gentoximicin B-t és C anyagot tartalmazó vizes oldatból, amely célszerűen valamely erjesztéses oldat, az antibiotikumokat ammonium formájú finomszemcsés kationcserélő gyantán, célszerűen divinilbenzolt tartalmazó metakrilsav vázas karboxil típusú gyantán, előnyösen Amberlite CG—50 vagy BioRex—70 gyantán kötjük meg, majd az ioncserélőről a hatóanyagokat célszerűen 0,10—0,15 normál ammóniumhidroxiddal oldjuk le. Ebben az esetben a hatóanyagok a gyantáról gentamicin B, gentamicin B,, A, B, C—anyag, sziszomicin, E, D—anyag sorrendben oldódnak le. Egyes anyagok között, elsősorban a gentamicin B, B, és az A, B, C anyagok, valamint a sziszomicin és az E-anyag vonatkozásában jelentős átfedés tapasztalható, így ezeket az anyagokat tisztán csak további elválasztási lépésekkel lehet előállítani. Ezen anyagok egymástól történő elkülönítésére karboxil típusú kationcserélő anyagokon végzett kromatográfiás műveletek önmagukban nem elegendők. Ezért a fenti módon kapott antibiotikumokat tartalmazó valamennyi eluátum frakciót egyesítjük. Az így kapott antibiotikum elegyet erősen bázisos anioncserélő gyantán, célszerűen polimetakrilsav vázas, divinilbenzollal kopolimerizált ammonium vagy alkilammónium aktív csoportokat tartalmazó finomszemcsés, hidroxil formájú gyantán, célszerűen Dowex 1 x 2 gyantán, ionmentes vízzel kromatografáljuk. Az ily módon végzett ionkizárásos kromatográfiával az antibiotikum elegyet viszonylag apoláris, kevesebb hidroxil-csoportot tartalmazó (sziszomicin, A, B, és D anyagok) és poláris (gentamicin B. 4 5 gentamicin B,, C és E anyagok) összetevők elegyeire választjuk szét. Ez a különleges elkülönítési módszer teszi lehetővé a hasonló bázicitású, tehát ioncserélő kromatográfiával el nem különíthető, de eltérő polaritású (több, illetve kevesebb hidroxilcsoportot tartalmazó) antibiotikumok elválasztását. A viszonylag apoláris összetevők igen gyorsan leoldódnak az anioncserélő oszlopról, viszont a poláris komponensek a kevésbé poláris komponensektől jól elválva a későbbi frakciókban találhatók. A viszonylag apoláris komponensek elegyét ezután kationcserélő gyantán vagy dextrán-gélen végzett újabb ioncserélő kromatogáfiával, lényegileg a 168 778 sz. szabadalomban ismertetett módon alkotórészeire választjuk szét. Ily módon a sziszomicint igen nagytisztaságú állapotban a poláris komponesektől és egyéb szennyezésektől (D anyag) gyakorlatilag mentesen állíthatjuk elő. A viszonylagosan apoláris komponensek ioncserélős szétválasztásnál az előfrakciókból tiszta állapotban kapható a két új antibiotikum, a gentoximicin A (A anyag) és gentoximicin B (B anyag). A poláris komponenseket tartalmazó frakciókat ismert módon, például CM-Sephadex-C-25 ioncserélő dextrán-gélen történő ammóniás kromatográfiával választhatjuk szét komponenseikre. A híg vizes ammonium bázisokkal végzett szelektív leoldás hatékonysága adott esetben 5—10% rövidszénláncú alkanol hozzáadásával növelhető. Ily módon az A, B és C anyagoktól gyakorlatilag mentes, nagytisztaságú gentamicin B-t és B,-et állíthatunk elő. A szétválasztott antibiotikumokat szabad állapotban, vagy kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható savakkal képzett sóik alakjában különíthetjük el. A sóképzés adott esetben az elkülönítést követően is elvégezhető. A gyógyászatilag elfogadható savakkal képzett sók közül különösen előnyös a szulfát-sót elkülöníteni, ugyanis a fenti antibiotikumok szulfát-sói közvetlenül alkalmasak gyógyászati készítmény előállítására. A találmány szerinti eljárásban kiinduló anyagként mikrobiológiai úton kapott fermentlevek, vagy bármely más úton kapott, gentamicin B-t, Bret, sziszomicint, valamint gentoximicin A-t és B-t együttesen vagy a komponenseknek csupán egy részét tartalmazó vizes oldatok felhasználhatók. A fenti antibiotikumokat tartalmazó fermentleveket előnyösen valamely, a fenti antibiotikumok termelésére képes Micromonospora törzs, pl. a Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs tenyésztésével állíthatjuk elő. Ilyen fermentlevek előállíthatok azonban bármely olyan mikroorganizmus fermentációja során is, amelyek a fenti antibiotikumok bioszintézisére képesek. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
