193522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán proinzulint tartalmazó gyógyszertészeti készítmények előállítására
helyek foglalkoznak a humán proinzulin előállításával: Peptides: Synthesis-Structure-Function: Proc, of the Seventh American Peptide Symposium, 1981: Pierce Chemical Company, Goeddel és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76, 106-110 (1979), Ross, M. J.: National Institutes of Health Recombinant DNA Technology Bulletin, 3, 1-11 (1980). A humán proinzulin előállításával ezenkívül még a következő összefoglaló munkák (reviews) foglalkoznak: Steiner, D. F. és munkatársai: Diabetes, 8th. Proc. Congr. Int. Diabetes Fed; Excerpta Med., Amsterdam, 1974, Rubenstein, A. H. és munkatársai: Pec. Prog. Horm. Rés., 33; Academic Press, New York, -1977, Kitaloshi, Metabolism., 26, 547-587 (1977), Proinsulin, Insulin, C-peptides: Excerpta Medica, Amsterdam,_ 1979, 468. old. összefoglalva, a fenti irodalmak egyike sem tartotta alkalmasnak a proinzulint gyógyászati alkalmazásra, annak jelentőségét kizárólag inzulin prekurzorként látták. Hatását az inzulinéval azonosnak, azonban lényegesen gyengébbnek tartották. Az inzulin ipari előállítása során is arra törekedtek, hogy a proinzulint teljesen eltávolítsák a készítményből, anélkül, hogy az elválasztott proinzulint felhasználták volna. A találmány olyan gyógyszerészeti készítményekre vonatkozik, amelyekkel a cukorbajos beteg szervezetének természetes hormonális állapotát jobban fenntarthatjuk, mintha egyedül inzulint adagolnánk. Így a találmány olyan gyógyszerészeti készítmények előállítására vonatkozik, amely humán proinzulint tartalmaz, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt. A találmány szerinti hatóanyagot úgy állítjuk elő, hogy a) proinzulint kódoló DNS-szekvenciával rendelkező, rekombináns DNS-technikával előállított E. coli törzset fermentációs körülmények között tenyésztünk, majd a kapott proinzulint elkülönítjük, vagy b) a proinzulin peptid-szekvenciájának megfelelő, a peptidkémiában ismert védőcsoportokkal védett termékről lehasítjuk a védőcsoportokat, vagy c) a proinzulin lineáris peptid-szekvenciájának megfelelő, szabad -SH csoportokat tartalmazó peptidben létrehozzuk a diszulfid- kötéseket, majd az előállított humán proinzulint legalább egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, adott esetben kétértékű cinkion-forrással és/vagy protaminnal keverve szokásos dózisformává, célszerűen oldat vagy injekció formává alakítunk. A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmények alapvető összetevője a fenti módszerekkel előállított humán proinzulin. 3 A találmány szerinti készítményekkel ada g olt humán proinzulin lévén természetesebben használódik fel a glükóz, és a vér glükóz - - tartalma jobban szabályozódik, ezzel elkerülhetők az előzőekben ismertetett kedvezőtlen diabetikus komplikációk. A humán proinzulint több forrásból beszerezhetjük; például szerves szintézissel, ismert módszerrel való humán hasnyálmirigyből kiinduló izolálással és — jelenleg — a rekombináns dezoxi-ribon jkleinsav-módszerrel. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-módszerrel való proinzulin előállítása — a 37255 sz. európai nyilvánosságrahozatali irat szerint — nagy vonalakban úgy történik, hogy izolálással, szintézissel vagy e kettő kombinációjával a humán proinzulin aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő. Ezután a humán proinzulint meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat leolvasási fázisban beépítjük egy megfelelő klónozó és kifejeződő hordozóba. A hordozóval megfelelő mikroorganizmust transzformálunk , a transzformált mikroorganizmust pedig ezután megfelelő fermentációs körülmények között tenyésztjük. Ekkor további proinzulin gént tartalmazó vektorokat kapunk, és kifejeződik a proinzulin vagy egy proinzulin prek mzor. Abban az esetben, ha a kifejezendő termék egy proinzulin prekurzor, úgy az általában a humán proinzulin aminosav-szekvenciájábol áll, amely amino-terminális végén egy olyan protein fragmenshez kapcsolódik, amely közönséges körülmények között annak a génnek a terméke, amelybe a proinzulin gént beépítettük. A proinzulin aminosav-szekvenciája specifikusan hasítható helyen kapcsolód k a protein fragmenshez, ez általában metion n. Ezt a terméket általában fuzionált génterméknek nevezzük. A proinzulinnak megfelelő aminosav-szekvenciát cián-bromiddal lehasítjuk a fuzionált géntermékről, ezután ismert módszerekkel stabilizáljuk a proinzulin aminosav-szekvencia ciszteineiben lévő szulfhidril-csoportokat, o'y módon, hogy a megfelelő S-szulfonátokká alakítjuk azokat. A kapott proinzulin S-szulfonátot tisztítjuk, a tisztított proinzulin S-szu!fonátot ezután a három megfelelően elhelyezkedő diszulfid-kémiai kötés kialakításával proinzulinná a'akítjuk át. A kapott proinzulin terméket tisztítjuk. Ahogy azt már jeleztük, a találmány szerinti készítményekkel elősegítjük a természetes hormonális állapot fenntartását, és ezáltal meggátoljuk vagy gyakorlatilag teljesen kiküszöböljük vagy késleltetjük a diabetikus komplikációkat. Felismerték, hogy egyes betegek képtelenek hatékonyan felvenni az inzulint szubkután injekción át; ennek oka proteázok jelenléte az injekció helyén, ezek az enzimek, mielőtt az inzulin abszorbeálódhatna a véráramba és elvándorolhatna a. receptor helyek-4 3 193522 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
