193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 14 eljárásával vonjuk ki (Biochemislry 9, 4428-40 (1970)). Ezt a plazmid DNS-t Hind III restrikciós enzimmel hasítjuk el. Az emésztett plazmid DNS -1 kis mennyiségű etidium bromiddal keverjük össze és szeparáljuk El-Gewely és Helling szacharóz-grádiens módszerével (Anal. Biochem 102, 423-428 (1980)). Az alfa-amiláz gént tartalmazó 3,6 Md fragmenst extraháijuk kétszer n-butilalkohollal, kicsapjuk azonos térfogatú izopropil-alkohollal és szuszpendáljuk Tris-re 10 mmólos, EDTA-ra 1 mmólos (pH 7,5) keverékben, majd felhasználásig 20'C-on tartjuk B Vektor készítése. Egy B. subtil is törzset amely a Bacillus Genetic Stock Centerben (Department of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio Egyesült Államok) 1 E 17 számon áll rendelkezésre, és amely klóramfenikol rezisztenciát átvivő génnel rendelkező, 2,0 Md vei jellemezhető pC 194 plazmidot tartalmaz — tripton-szója agart (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, a továbbiakban Difco) és 50 mikrogramm klóramfenikolt tartalmazó lemezre szélesztünk A sejteket ezután 1 l-es lombikban levő 150 ml Penassay tápközegbe inokuláljuk, és a sejteket egy éjszakán át növesztjük 37 C on rázatva. A sejteket ezután elválasztjuk és újra szuszpendáljuk 10 ml protoplaszt készítő pufferban, amely szacharózra 25 % os, NaCI re, 0,1 mólos, Tris HCl-re 0,05 mólos (pH 7,5) és EDTA-ra 0,05 mólos (pH 8,13) 5 mg tojásfehérje lizozimot (Sigma Chemical Company) adunk hozzá és 30 percig 37 C on tartjuk Ezután finoman hozzákeverünk 13 ml 2 % os nátrium dodecilszulfátot (NaCI re 0,7 mólos oldatban) majd 2,4 ml 5 mólos NaCI oldatot. A keveréket jeges vízben lehűtjük és 12 100 g vei 20 percen át centrifugáljuk A DNS t azonos térfogatú izopropilalkohollal kicsapjuk A szilárd anyagot 60 órán át jeges vízben tartjuk, majd centrifugálással kinyerjük és Tris hidrokloridra 0,01 mólos, EDTA-ra 0,001 mólos oldatban (pH 7,5) szuszpendáljuk A plaz mid DNS t CsCI etidium bromid ultracentrifugálással különítjük el Radloff és munkatársai módszere szerint (Proc. Natl. Acad Sei., US A , 57, 1514 1521 (1967)). A 2 Md-vei jellemezhető plazmidot izopropilalkoholos extrakcióval és Tris-re 10 mmólos EDTA-ra 1 mmólos (pH 7,5) keverékbe történő extenzív dialízissel kezeljük. C A kiméra plazmid készítése A 2 Md-vel jellemezhető vektort, amelyet a B rész szerint nyerünk, Hind Ili restrikciós enzimmel elhasítjuk és összekeverjük az A. rész szerint nyert, 3,6 Md- vel jellemezhető DNS fragmenssel. A vektor és a donor DNS koncentrációja 6 mikrogramm/ml, illetve 17 mikrogramm/ml Az öszszekapcsolást az 1 példában leírt általános módszerrel végezzük Mindenféle, 3,6 Md-vel jellemezhető lineáris fragmens távolléte az összekapcsolás után — amely agaróz gél elektroforézissel mutatható ki — jelzi, hogy az öszszekapcsolas teljes D A kiméra plazmid transzformációja a B. 13 subtilisbe. Amiláz gént nem tartalmazóé, subtiiis ATCC 31 785 törzs tenyészetét egy éjszakán át növesztjük egy tripton-vór agart (Tryptose-Blood Agar Base (Difco)) és 1 % oldható keményítőt tartalmazó lemezen. A lemezre 2 ml, következő összetételű tápközeget helyezünk: % (NH4)2S04 0,2 K2HP04 1,4 KH2P04 0,6 Nátriumcitrát 2 H20 0,1 MgS04.7H20 0,12 Glükóz 0,5 Kazein-aminosavak (Casamino Acids (Difco)) 0,02 L-triptofán 0,005 Az így nyert sejtszuszpenzió mintegy 0,1 ml-ét 10 ml azonos összetételű tápközegbe juttatjuk, amely 250 ml-es lombikban helyezkedik el, és 37°C-on élénken rázatjuk 4 órán át. Ezután a tenyészet 1 ml-ét 9 ml 37"C-on előmelegített transzformációs tápközegbe helyezzük, és folytatjuk a rázás közbeni inkubálást 90 percen át A transzformációs tápközeg azonos a növesztő tápközeggel azzal a kivétellel, hogy a kazein-aminosavakból 0,01 %-ot és L-triptofánból 0,0005 %-ot ^tartalmaz. 0,25 ml sejthez, amely mintegy 1.10Ö sejtet tartalmaz milliliterenként, 5 mikroliter.aC. rész szerint nyert, 0,12 mg plazmidot tartalmazó oldatot adunk hozzá A keveréket enyhén rázzuk 37 C-on 30 percen át A keveréket hígítjuk azonos térfogatú Penassay tápközeggel (Difco) és folytatjuk a rázatást 37 C-on további 90 percig. A sejteket 0,1 ml-es alikvotokban tripton-vér agart (Tryptose Blood Agar Base (Difco)), 1 % oldható keményítőt és 20 mikrogramm klóramfenikolt tartalmazó lemezre szélesztjük. Kontrollként egyrészt hozzáadott plazmid nélküli B. subtilis, másrészt pC 194 vektorplazmidot tartalmazó B. subtilis sejteket szélesztünk azonos tápközegre A lemezeken nem láthatók azoknak a sejteknek a telepei, amelyek nem tartalmaznak hozzáadott plazmidot. Azokon a lemezeken, amelyekre pC 194 plazmidot tartalmazó sejteket vittünk fel, három kolónia helyezkedik el, de a telepek egyike sem mutat amiláz aktivitást. Egy telep figyelhető meg azokon a lemezeken, amelyekre a C. rész szerint nyert kiméra plazmid DNS-el rendelkező sejteket szélesztettünk. Ez jódgőzös előhívással világos zónát ad. jelezve, hogy ezek a sejtek extra-celluláris amiláz enzimet termelnek. A sejtek láthatóan klór - amfenikol jelenlétét igénylik stabilitásukhoz. Ez a tenyészet ATCC 31 786 számon áll rendelkezésre. Az amilázt tartalmazó telepből származó DNS egy mintáját agaróz gél elektroforézissel különítjük el. 5,6 Md-nél figyelhető meg a plazmid sávja. Ez megfelel a C rész szerint előállított kiméra plazmid méretének. A tisztított kiméra plazmidot Hind III restrikciós enzimmel elhasítjuk és agaróz gél elektro forézisnek vetjük alá Két fragmenst nyerünk, amelyek 2,0 Md-vel és 3,6 Md-vel jellemezhe-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
