193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 15 16 tők Ezek megfelelnek az A. rész szerint nyert donor DNS, illetve a B. rész szerint nyert vektor DNS méretének E. A kiméra plazmid transzformációja egy másik B. subtilis törzsbe. Az amiláz gént tartalmazó kiméra plazmidot a D. rósz szerint nyert amiláz termelő telepek sejtjeiből izoláljuk a B. részben nyert pC 194 plazmid izolálásához használt módszerrel. Az izolált kiméra plazmi dot transzformáljuk egy másik, amiláz negatív B. subtilis törzsbe, amely 1 A 289 számon áll rendelkezésre a Bacillus Genetic Stock Centerben (Dept of. Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio, Amerikai Egyesült Államok). A transzformációt S. Chang és S N. Cohen protoplaszt-fúziós módszerével végezzük (Molec. Gen Genet. 1 18,111-115 (1979)) Amikor a sejteket a D rós£ szerinti lemezeken növesztjük, mintegy 1 108 telep/ml látható azokon a lemezeken, amelyek nem tartalmaznak klóramfenikolt Kb 1 103 telep/ml látható a klóramfenikolt tartalmazó lemezeken Mindegyik telep mutat amílázaktivitást a keményítő-jód vizsgálat szerint Ez az amilázt tartalmazó B. subtilis ATCC 31 784 számon áll rendelkezésre W példa A kiméra plazmidot tartalmazó B subtilis altat termelt alfa amiláz hőstabilitasa A 9 példa E része szerint előállított kiméra plazmidot tartalmazó B subtilis törzset (ATCC 31784) 2,8 literes Fernbach palackban 1 liter 5 10 15 20 25 30 következő összetételű tápközegben növesztjük Kukoricakeményitö 9,0 Kukoricalekvár _ 6,0 Élesztőautolizátum ® 0,35 <NH4)2HP04 10 KH2PO4 0,1 CaCI2.2H20 0,06 MnCI24U20 0,05 Kukoricaolaj L,0 (0,05 egység/ml) 154, az Amber Laboratories cég nél áll rendelkezésre (Juneau, Wisconsin) A tápközeget 30 percig autoklávozzuk 121 C-on, amely hőmérséklet a Termomyl aktivitását elpusztítja, majd szobahőmérsékletre hűtjük Ezután 0,01 mg klóramfenikolt milliliterenként adunk a tápközeghez, majd a sejtekkel inokulaljuk A tenyészetet centrifugáljuk, és a felülúszó folyadék hígított mintáin végezzük el a hőstabilitási vizsgálatot az 5. példa szerinti általános módszerrel. Összehasonlításul a B. stearothermophi ~ lusból, B. subtilisbö\ nyert amilázok, valamint a Termamyl hőstabilitását is megmértük, nátriumacetára 50 mmólos és CaCl2-re 2,5 mmólos inkubációs tápközegben (Ezek az összehasonlító amilázok az 5 példában is.) Ennek a vizsgálatnak az eredménye a II Táblázatban látható Termamyl ^Prymex II. TÁBLÁZAT Enzim minta Kezdeti aktivitás egység'ml Aktivitás 45 perces, 90 C-os hőkezelés után, Egység/ml Maradék aktivitás % B stearothermophilus 1,81 1 16 64 B subtilis 1,34 0 0 Termamyl 1,26 0,79 63 ATCC31 784 bői származó enzim 1,58 1,07 68 Ebben a vizsgálatban a B. subtilis ATCC 31 784 klón által termelt amiláz láthatóan legalább olyan höstabil, mint a B. stearothermophilus donor által termeit enzim Hőstabilitásra vetekszik a Termamyl kereskedelmi hőstabil alfa-amiláz hőstabilitásával, és hőstabilitása szemmel láthatóan kiválóbb, mint a B. subtilis alfa - -amilázé. Az eddig leírtakból nyilvánvaló, hogy a találmány kapcsán olyan eljárást mutatunk be hőstabil alfa-amiláz enzimet kódoló gént tartalmazó kiméra plazmidok létrehozására és alkalmazásukkal hőstabil alfa-amiláz készítésére, amely teljesen megfelel a fent említett tárgynak, és amely teljesíti a fenti célt és előnyöket Bár a jelen szabadalmi leírás csak bizonyos mégha tározóit kiviteli formákat ír le, nyilvánvaló, hogy alternatívák, módosítások és variációk kidolgozása nyilvánvaló az ezen a területen jártas szak emberek számára a jelen szabadalmi leírás alapján. Ezért a jelen szabadalmi leírás szerinti minden ilyen alternatíva, módosítás és variáció az ezt követő igénypontok oltalmi körébe tartozik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hőstabil alfa amiláz kódoló génnel rendelkező kiméra plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) a) Bacillus stearothermophilus mikroorganizmusban természetes formában előforduló, hőstabil alfa-amiláz kódoló gént tartalmazó plazmidot Hinü III restrikciós enzimmel hasítunk, vagy b) Bacillus stearothermophilus höstabil alfa-amiláz kódoló génjét tartalmazó kiméra plazmidot Hind III restrikciós enzimmel hasítunk alfa-amiláz kódoló gént tartalmazó lineáris DNS szekvenciát nyerve, (ii) pBR322, pBR325, pWL625 vagy pCl94 plazmidot Hind III restrikciós enzimmel hasítunk egy második lineáris DNS szekvenciát nyerve, 9 50 55 60 65
