193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 kiónozott darabja, amelyet az 1 példa plazmidjainak analíziséből nyertünk Ez a kísérlet világosan jelzi, hogy legalább egy alfa-amiláz gén helyezkedik el az alkalmazott B stearothermophilus természetesen előforduló plazmidjaiban 7. példa Különböző kiméra plazmidokat tartalmazó E coli törzsek készítése és izolálása A A3 példa szerint izolált amiláz termelő E coli (ATCC 31 789) törzs tenyészetét egy éjszakán át növesztjük a 2. példában alkalmazott tápközegben. A plazmid DNS t megsokszoroz zuk D B Clewell módszere szerint (J Bacteriology, 110, 667 676 (1972)), 170 mikrogramm klóramfenikolt használva milliliterenként 11 Na2HP04 g/liter 6,0 KH2PO4 3,0 NaCI 0,5 NH4CI 1,0 Kazein aminosavak thidrolizátum) 5,0 Glükóz 2,0 CaCl2 2H2O 0,015 MgS047H2Ú 0,246 Bi vitamin 0,001 A plazmid DNS t ezután Clewell és Helinski standard tisztított lizátum módszerével izoláljuk (Biochemistry 9, 4428-4440 (1970)) Az izolált plazmidot a 6 példa szerinti CsCI etidiumbromid módszerrel, majd izopropanolos extrakcióval, végül Tris-re 10 mmólos, EDTA ra 1 mmólos (pH 7,5) oldatba történő extenzív dialízissel tisztítjuk 3,9 Md vei jellemezhető pBR 325 plazmidot tartalmazó E. coli RRi (PRC 399) tenyészetét növesztjük és a plazmid DNS t sokszorozzuk, izoláljuk és tisztítjuk az előző bekezdés szerinti módszerrel A két forrásból származó plazmid DNS-t Hind III restrikciós enzimmel elhasítjuk Az elhasított plazmidok oldatait összekeverjük, és 0 C on 18 órán at összekapcsoljuk az I példa szerinti általános eljárással Az összekapcsolt DNS-t E coli RRi-be transzformáljuk a 2 példában leírt módszer szerint A sejteket hígítjuk, és 25 mikrogramm/ml koncentrációban klóramfenikolt tartalmazó agar lemezre szélesztjük Ezzel a módszerrel csak azokat az E coli sejteket nyerjük ki, amelyek tartalmazzák a klóramfeníkor rezisztenciával rendelkező pBR 325 plazmidot A sejtek megjelent telepeit osztályozzuk amiláz aktivitásra a 3 példában leírt módszer szerint, D cikloszerint használva a sejt líziséhez Három telepből, amely amiláz aktivitást mutat és klóramfenikolra rezisztens, rekombináns plazmid DNS t vonunk ki a 4 példa szerinti tisztított lizátum módszerrel A rekombináns plazmidok szétválasztása agaróz gélen azt mutatja, hogy ezek a plazmidok egy pBR 325 plazmid + egy amiláz gént tartalmazó 3,6 Md fragmens kombinációjának megfelelő méretűek A plazmid Hind III enzimmel végzett emésztésével 3,6 Md fragmenst és a pBR 325 lineáris formáját nyerjük. Ez a példa azt mutatja be, hogy az amiláz gént át lehet klónozni egy másik vektorra, pBR 325-re anélkül, hogy elveszítené amiláz-termelő aktivitását. Az így nyert E. coli törzs ATCC 31 792 számon áll rendelkezésre. B Az A. részben kialakított, klórámfenikol és ampicillin rezisztens kiméra plazmidot használjuk, mint olyan DNS fragmens donort, amely tartalmazza az alfa- amiláz gént. Ezt a fragmenst kombináljuk a 10 Md vei jellemezhető pWL 625 vektor-plazmiddal, az A részben leírt általános módszerrel A pWL 625 plazmidot W. Goebel és munkatársai írták le (Molec. Gen. Genet. 157 119-129 (1977)). Ezt az E. coli (ATCC 31 787) törzs tenyészetéből izoláljuk ennek a példának az A részében alkalmazott plazmid-izolálási módszerrel. Ez a vektor ampicillin és kanamacin antibiotikum rezisztenciát visel. DNS beiktatása pWL 625 be Hind III helynél megsemmisíti a kanamicin rezisztenciát. Az E. coli RR1 sejtek, amelyeket rekombináns DNS-el transzformáltunk, növekednek ampicillintartalmu agar lemezeken. Azokat a telepeket, amelyek rezisztensek klóramfenikora a pBR 325 miatt, ugyanakkor amiláz aktivitást mutatnak, szelektáljuk vizsgálat céljából A plazmid DNS t izoláljuk a telepekből Az analízis agaróz gélen Hind III al történő emésztés előtt és után azt mutatja, hogy az amiláz gént tar talmazó DNS fragmenst ráklónoztuk a pWL 625 plazmidra, ilyen módon új plazmidot alakítva ki. Ez a kiméra plazmidot tartalmazó E. coli törzs ATCC 31 791 számon áll rendelkezésre. 8. példa Két különböző kiméra plazmid transzformá ciója E. coli törzsbe. A 7. példa B része szerint készített amiláz termelő E. coli törzset növesztjük és élőké szítjük transzformációhoz a 2 példa szerinti el járással A 7 példa A része szerint készített tisz tított plazmidot transzformáljuk ezekbe a sej tekbe. Amikor a képződött sejteket klóramfenikolt tartalmazó agar lemezen növesztjük, minden telep mutat amiláz aktivitást Plazmid DNS t izolálunk az egyik telepből és agaróz gélen analizáljuk A 7 példa A és B részében leírt kiméra plazmid mindegyikét megtaláljuk. Ez a kísérlet azt demonstrálja, hogy az E. coli növekedhet és fenntarthat egyidejűleg két különböző, alfa-amiláz gént tartalmazó kiméra plazmi' dot (A plazmidok kombinációjának hosszú időtartamú vizsgálatát nem végeztük el) Ezt a két kiméra plazmidot tartalmazó E. coli törzs az ATCC-nél 31 790 számon áll rendelkezésre. 9 példa Alfa-amiláz gént és antibiotikum rezisztencia markert tartalmazó plazmidok transzformációja B. subtllis törzsbe. A Donor DNS készítése. A 7 példa B része szerint készített kiméra plazmidot használjuk alfa amiláz gént tartalmazó DNS fragmens donorként Ezt Clewell és Helinski tisztított lizátum 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
