193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 teflon szalaggal is lezárunk. Az oldatot amiláz aktivitásra megvizsgáljuk hőkezelés előtt, majd 90 C on, 45 percen át történő hőkezelés után Az amiláz aktivitást a keményítő hidrolízisének aranyában határozzuk meg, ez az arány a jód- festési kapacitás spektrofotometriásán mérhető csökkenésével mutatható ki B.W. Smith és J H Rowe általános módszere szerint (J. Bioi. Chem , 179, 53 (1949)) Az E. coli kontroll nem mutatott amiláz aktivitást. B. stearothermophilusbó\ (ATCC 31 783) nyert tisztított amilázt, B. subtihsból nyert Sigma A 6380 amilázt (Sigma 9 Chemical Co St Louis, Missisipi, Egyesült Államok) és Termanyl nevű hőstabil alfa-amilázt (Novo Laboratories Inc, Wilton, Connectitut, Egyesült Államok) adunk az E. coli kontroll lizátumához, ez szolgál standardként a hőstabilitás méréséhez. (Bár a Sigma Chemical Company katalógusa ezt az enzimet B subti/isbő\ származó alfa-amilázként nevezi meg, H Chung és F. Freiberg kimutatták, hogy ez Bacillus árnyloliquefaciensbő\ származik (Biochem J. 185, 387-395 (1980)) A vizsgálat eredménye az I. Táblázatban látható. 10 5 10 I Táblázat Hőstabilitási adatok A sejt lizátum eredete Kezdeti aktivitás Aktivitás Maradék egység/ml 45 perces aktivitás 90"C-on történő hő% kezelés után egység/ml E coli RRi (kontroll) Kontroll +■ B. stearothermoph/lus (ATCC 31783) törzsből származó alfa amiláz Kontroll + Termamyl Kontroll -r B. subtilis törzsből származó alfa -amiláz (Sigma A 6380) Kontroll i-1. Klón Kontroll +2. Klón Kontroll 4-3. Klón Kontroll +4 Klón A klonok által termelt amiláz legalább annyira höstabilnak látszik, mint a B. stearothermophilus donortörzs által termelt amiláz, A kiónok által termelt amiláz hőstabilitása mintegy azonos a Termamyl nevű kereskedelmi hőstabil alfa amiláz hőstabilitásával, és feltétlenül jobb a B subtilis bői nyert alfa amíláz hőstabilitásánál A különböző amilazokkal emésztett keményítők hidrolizátumait vékonyréteg kromatográfiával analizáljuk, hogy azonosítsuk a termelt kis molekulasúlyú cukrokat Az E coli kiónokkal nyert amilazok alkalmazásával képződött kis molekulasúlyú cukrok relatív mennyisége hasonló a kontrollként használt ismert alfaamilázok alkalmazásával képződött cukrok mennyiségéhez Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a rendkívül termofil törzsekből nyert hőstabil enzim génjei megbízhatóan kifejeződnek a mezofil gazda baktériumban, hőstabil enzim terméket adva Arra jöttünk rá tehát, hogy a rendkívül termofil baktérium génjeit kifejezésre lehet juttatni mezofil baktériumokban, rekombináns DNS technikát használva. Sőt, az aktív hőstabil enzim szintézise normál mezofil hőmérsékleten (20”C-40C) történik. 6. példa Alfa-amiláz gént tartalmazó, természetesen előforduló plazmid izolálása 0 0 0,21 0,15 71,4 0,39 0,34 87,2 0,21 0,01 4,8 0,45 0,38 84,4 0,22 0,18 81,8 0,36 0,29 81,0 0,42 0,35 83,3 Az 1. példában megadott módon B. stearothermophilus ATCC 31 783 sejtjeiből a teljes DNS-t izoláljuk. A plazmid DNS-t a teljes DNS-ből CsCI-etidium bromid ultracentrifugálással 40 választjuk ki R. Radloff, W. Bauer és J. Vinog rád módszere szerint (Proc. Natl. Acad. Sei, U S A., 57, 1514-1621 (1967)). Azt, hogy ez a plazmid tartalmaz-e alfa-amilázt, a következő eljárással mutatjuk ki: 45 Plazmid DNS-t hasítunk el Hind III restrikciós enzimmel az 1 példában leírtak szerint. Kiónokat képezünk, ezt a DNS-t E. coliba bejuttatva az 1-3. példák szerint leírt módon. A tetra-0 ciklin-rezisztencia fenotípus-analízis szerint a sejtek 3,3 % a tetraciklin-rezisztens, tehát tartalmaz klónozott DNS-t. A sejtek osztályozása alfa-amiláz aktivitásra azt mutatja, hogy 0.42 %, vagyis a klónozott DNS-t tartalmazók közül kb. minden nyolcadik sejt tartalmazott amiláz 55 gént. A B. stearothermophilus plazmidokat Hind lll-al hasítva lineáris DNS darabok kelet keznek, amelyek 8 detektálható csíkká szeparálódnak agaróz gélen történő elektroforézissel Az amiláz darab klónozásának frekvenciája bU (1/8) körülbelül megfelel az elvárásnak, ha feltételezzük, hogy a nyolc jellegzetes csíkból egy rendelkezik az amiláz génnel. Sőt, ezeknek a plazmid-csíkoknak az analízise azLmutatja, 65 hogy a csíkok egyike kb. 3,6 Md nél van, vagyis azonos méretű, mint annak a DNS-nek a
