193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 egyes kodonoknak vagy kodonok valamilyen kombinációjának a kicserélése más aminosavakat vagy hosszabb vagy rövidebb HuIFN-ß-rokon polipeptidet ad; ezáltal hasznos irányban változtathatjuk meg a termék tulajdonságait (például növeljük annak stabilitását, növeljük oldhatóságát vagy vírus-ellenes aktivitását, fokozhatjuk a 2,5-A szintetáz-aktivitást vagy növelhetjük a gazda-specifitási tartományt). Az így elérhető javítások egyik példája az, hogy egy e találmány szerinti DNS-fragmenst, amely pre-lFN-ß-ra kódoló DNS-szekvenciát tartalmazott, beiktattunk egy olyan klónozó vektorba, amely a promotort és az e promoter által szabályozott SV40 összekötő-szekvenciát tartalmazta. Ez a konstrukció majom-sejtekben körülbelül 104 egység/ml feldolgozott IFN-ß termelését eredményezte. A jelen találmány kiterjed hasonló konstrukcióknak más klónozó vektorokban és eukariota sejtekben való létrehozására is. Végül a jelen találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák által termelt polipeptidek aktivitása javítható a találmány szerinti DNS-szekvenciák vagy polipeptidek ismert módszerekkel történő fragmentálása, módosítása vagy származékok képzése útján is, anélkül, hogy ezzel túllépnénk a találmány körét. Egy HuIFN-ß-ra kódoló kromoszóma-gén azonosítása R. M. Lawn és munkatársai egy humán magzati kromoszóma-DNS fragmensekből származó hibrid fág-gyűjteményt állítottak elő, ezeket HaelII és Alul alkalmazásával végzett részleges hasítással képezték és Eco Rí kapcsolókkal kapcsolták k Charon 4A karokhoz a Cell, 15, 1157-1174 (1978) helyen ismertetett módon. Ezt a gén-bankot egy „in situ" módszerrel [W. D. Benton és R. W. Davis, Sicence, 196, 180—182 (1977); T. Maniatis és munkatársai: Cell 15, 687—701 (1978)] vizsgálták, szondaként a pHFIF-21- ból Taql-BglII resztrikció útján kimenesztett, 32P-ve! jelzett IFN-ß cDNS betétet használtuk. A .pHFIF-21 plazmidot az e találmány szerinti szkrinelési eljárással azonosítottuk (A 21. hibrid plazmid, amely humán fibroblaszt interferon cDNS inszertet tartalmaz). E plazmid Taql-BglII fragmense tartalmazza az IFN csaknem teljes 5’-lefordítatlan tartományát és teljes kódolási tartományát is. Egy hibridizálásra pozitív fág-klónt 600 000 piákból különítettünk el, ismételt plak-tisztítás útján (T. Maniatis és munkatársai: i.m.). Ezt a piakot k CH4A-gHFIF-l jelzéssel jelöltük. E plak resztrikciós analízise során kitűnt, hogy az körülbelül 16,3 Kb humán DNS-t tartalmaz. A k CN4A-gHFIF-l EcoRI-vel való kezelése a két Charon 4A fág-kar mellett 8 betét-fragmenset tartalmazott, 4,6, 3,5, 2,4, 1,9, 1,3, 1,2, 0,8 és 0,6 Kb hosszúságban. Southern megfestés után csak az 1,9 Kb fragmens hibridizált a pHFIF-21 Taql-BglII fragmensére. 71 Az 1,9 Kb fragmenst közvetlenül visszaklónoztuk az EcoRI helyre a pBR325-ben (ez a pBR322 oly származéka, amely egy kloramfenikol-rezisztens jelzőt is hordoz, amely egyetlen .EcoRI helyet tartalmaz [R. Rentki és munkatársai, The plasmid cloning vektor pBR325 contains a 482 basc-pair-long inverted duplication, Gene 14, 289 (1981)]). 0,6 u.g EcoRI- vel kezelt k CH4A-gHFIF-l DNS-nek 100 ng pBR325-höz való kötése és E. coli HBlOl-be való transzformáció után néhány kiónt szelektáltunk. Csak az 1,9 Kb fragmenst tartalmazó kiónok hibridizáltak az IFN-ß cDNS szondára. Ezt a kiónt p(325)-gHFIF-4 jellel jelöltük. A pHFIF-21-ből és a p(325)-gHFIF-4-bői származó resztrikciós fragmensek összehasonlítása azt mutatta, hogy a kromoszóma-klónban nincsenek közbelépő szekvenciák, továbbá hogy az e klón által hordozott DNS-információ azonos a pHFIF-21-ével. A HuIFN-ß-ra kódoló kromoszóma-DNS azonosítása és elkülönítése lehetővé teszi a megfelelő gazdáknak az e DNS-sel való transzformációját és HuIFN-ß belőle történő expreszszióját. Ez az expresszió előnyös, minthogy a kromoszóma-DNS szekvenciákhoz asszociált különféle szignálok jelen lesznek az ilyen kiónokban. Ezek a szignálok azután rendelkezésre fognak állni arra a célra, hogy nagyobb hozamokat kapjunk a kromoszóma-DNS kódoló tartománya által kódolt polipeptid expressziója és esetleg expresszió utáni kezelése során. Az itt leírt eljárások során előállított rekombináns DNS-molekulák és létrehozott mikroorganizmusok példáiként az alább felsorolt kultúrákat helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság) kultúra-gyűjteményében 1980. április 2-án; ezeket a kultúrákat HFIF-A—HF1F-C kultúraként azonosítottuk: A: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst) /HFIF3) B: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF6) C: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF7) Ezeket a kultúrákat a gyűjteményben DSM 1791, DSM 1792, illetőleg DSM 1793 nyilvántartási számmal jelölték meg. A találmány szerinti kultúrák további példáiként, ugyancsak a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság) kultúra-gyűjteményében 1980. június 5-én letétbe helyeztük a következő további kultúrákat is, amelyeket HFIF -D—HFIF-G kultúrákként azonosítottunk: D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) E: E. coli K12AHI (G-pPLa-HFIF-67-12) F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67- 12A19) G: E. coli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) Ezeket a kultúrákat a gyűjteményben DSM 1851 — DSM 1854 nyilvántartási számokkal jelölték meg. Letétbe helyeztük továbbá az American Type Culture Collection, (Rockville, Mary72 37 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
