193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 4 4361—4365, 1975), amelyet terminális transzferáz enzimmel állítottak elő. Plazmidok helyett fág-DNS-t is sikeresen alkalmaztak már klónozásra. A DNS-rekombináció során, különösen, ha kromoszóma-DNS fragmentumokat tartalmazó komplex keverékből indulunk ki, in vitro először nagyszámú különböző hibrid-molekula keletkezik. Meghatározott DNS-fragmentumok klónozásához'ezért egy szelekciós eljárásra van szükség, amely a transzformáció, illetve az átoltás után lehetővé teszi a keresett rekombináns DNS-t tartalmazó sejt-klónok elkülönítését. Ha a klónozásra kerülő frag-, mentum egy, a befogadó szervezetben hatóképes anyagcsere-gént hordoz, befogadóként jól transzformálható mutánsokat alkalmazunk, amelyekben a szóbanforgó' gén inaktiválódík, és amelyek a megfelelő anyagcsere-jellemzőt csak akkor mutatják ismét, amikor a gént, a rekombinált DNS-sel való transzformáció következtében, szaporodásra és ennek folytán átörökítésre képes alakban felvették. A találmány tárgya mindenekelőtt az, hogy egy önmagában ismert mutációs eljárásnak egy jól transzformálható E. coli törzsre, az E. coli K12 HB101-re való alkalmazásával egy eddig ismeretlen mutánst állítunk elő, amelyben a lúgos foszfatáz strukturgénje (phoA) inaktívált alakban van jelen. Ezt a mutánst a DNS-klónozásra irányuló fent említett eljárás alkalmazásával in vitro rekombinált DNS-sel való transzformációnak teszszük ki és olyan sejt-klónok elkülönítésére használjuk fel, amelyek lúgos foszfatáz géneket hordozó rekombinált DNS-t tartalmaznak. A J. Bacteriol. 119, 583.592, 1974 helyén leírt foszfatáz-negatív E. coli mutánsok esetében ezzel szemben olyan törzsekről van szó, amelyek — az in vivo restrikcióra és rekombinációra irányuló, még fennálló képességük következtében — rosszul transzformálhatok és ezért nem alkalmasak foszfatáz gének klónozására. Az említett mutációs eljárás során azokkal az N-nitrozo-vegyületekkel dolgozunk, amelyeket a mutációhoz általában alkalmaznak. N-nitrozo-vegyületként pl. nitrozo-karbamid és -guanidin vehető figyelembe. Különösen alkalmas vegyületnek bizonyul az 1-nitrozo-3-nitro-1 -metil-guanidin. A találmány tárgyát képezik olyan plazmid-vektorok is, amelyek lúgos foszfatázra jellemző DNS-szekvenciát tartalmaznak, valamint olyan DNS-szekvenciával rendelkező plazmidok, amelyek egy lúgos foszfatáz N-terminális aminosav-szekvenciáját kódolják. A találmány szerinti, phoA géneket tartalmazó plazmidok úgy állíthatók elő, hogy vad típusú baktériumokból származó DNS-t és egy antibiotikum-rezisztens plazmidotolyan restrikciós endonukleázokkal reagáltatunk, amelyek számára a plazmid felhasítási helyekkel rendelkezik, a felhasítási helyekhez DNS ligázt kapcsolunk, majd az E. coli K12 3 HBlOI-ből kapott E. coli SB44 phoA mutáns segítségével a fent leírt eljárás szerint lúgos foszfatáz strukturgéneket tartalmazó plazmidokat különítünk el. Ezekből a plazmidokból további, ugyancsak phoA géneket tartalmazó plazmidok állíthatók elő. Ezekből azután, restrikciós enzimek segítségével, a phoA géneket tartalmazó szub-fragmentumokaj vágunk ki és ezeket a szub-fragmentumokat antibiotikum-rezisztens vektor-piazmidokkal, DNS Iigáz jelenlétében rekombináljuk. Vad típusú baktériumokon olyan baktériumokat értünk, amelyeket a szakember a mikrobiológiai munkában rendszerint alkalmaz. Különösen alkalmasnak bizonyulnak az E. coli K12 és a Serratia marcescens.vad típusú törzsei. A találmány szerinti plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy pl. az E. coli K12 vad típusú baktériumokból származó teljes DNS-t és a pBR313 plazmidot — amely ampicillin-rezisztenciát közvetít — a BamHl restrikciós endonukleázzal felhasítjuk és DNS ligázzal •ekombináljuk. A fent említett foszfatáz-negatív mutánst (E. coli SB44) a ligázzal kezelt DNS-keverékkel transzformációs körülmények között inkubáljuk; ennek során a sejtek egy kis hányada (kb. 1/104) plazmid-DNS- t vesz fel. Ampicillin-tartalmú közegben való szaporítás révén, amelyben az ampicillinérzékeny mutánsok nem képesek növekedni, szaporítjuk a transzformált sejteket. A fel- Húsúit sejt-populációt nagyon alacsony foszfát-tartalmú agar lemezekre szélesztjük és 37°C-on inkubáljuk — ezzel maximális mértékben indukáljuk a foszfatáz-képződést —, majd az így kapott különálló telepekre p-nitrofenilfoszfát oldatot rétegezünk. A foszfatáz-pozitív telepek ezt az anyagot sárga p-nitrofenollá hidrolizálják (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—468., 1975). Átlagosan kb. 10000 színtelen telep között találunk egy sárga telepet. Ezekből a pho+ telepekből G.O. Humphreys et al. módszerével (Biochem. Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) plazmid-DNS-t különítünk el. Az így kapott és pSB47-teI jelölt plazmid elemzése — BamHI-ve! végzett hasítással és a bomlástermékek gélelektroforézisével — arra mutatott, hogy ez a kiindulási pBR313 plazmidból és egy további (kb. 11 milliárd mólsúlyú) DNS-fragmenturnból áll. Annak bizonyítására, hogy a pSB47 egy foszfatáz gént tartalmaz, ismételten elvégeztük az E. coli SB44 foszfatáz mutánsnak a plazmiddai való transzformációját. Ennek során kimutatható volt, hogy valamennyi ampicillin-rezisztens telep egyben foszfatáz-pozitív. Mivel a pBR3l3 plazmid nem tartalmaz lúgos foszfatáz gént, ez a gén a 1 1 milliárd molekulasúlyú járulékos DNS fragmentumon kell, hogy megtalálható legyen. A pSB51 plazmid előállítását a pSB47 plazmidéhoz teljesen hasonló módon végeztük azzal a különbséggel, hogy az E. coli DNS helyett Serratia marcescens-ből származó kromoszóma-DNS-t alkalmaztunk, vektorként 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
