193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 pWB-2-t vettünk és mind a kromoszóma-DNS-t, mind a vektort a HindlII restrikciós endonukleázzal hasítottuk. A plazmid (pSB51) a pWB2 vektoron kívül egy 2,5 milliárd molekulasúlyú DNS fragmentumot tartalmaz, amelyben a fentiekhez hasonlóan egy foszfatáz gént mutattunk ki. Ezenkívül az E. coli-ból és a S. marcescens-ből származó autentikus foszfatázokkal korong-elektroforézissel végzett összehasonlítás azzal az eredménnyel járt, hogy a pSB51 plazmidot hordozó E. coli sejtek a S. marcescens foszfatázzal azonos enzimet termelnek. Ez arra mutat, hogy a 2,5 milliárd molekulasúlyú DNS fragmentum, a pSB51 plazmidban a Serratia-DNS-ből származik és egy Serratia foszfatáz gént hordoz. Sok esetben lehetőség nyílik a plazmid további módosítására is anélkül, hogy az elveszítené lényeges tuljdonságait. így pl. a pSB47 plazmidban a 11 milliárd molekulasúlyú fragmentum a HindlII restrikciós endonukleázzal végzett hasítással több rész-fragmentumra bontható fel, amelyek közül a második legnagyobb (3,1 milliárd molekulasúlyú) fragmentum hordozza a foszfatáz gént. Ezt ligáz-kapcsolással és ezt követő transzformációval és szelekcióval — a fentiek szerint — egy, a pBR322 plazmidból (F. Bolivar et al., Gene 2., 95—113., 1977) levezetett ( p S B18) vektorhoz kapcsoljuk, amelyben hiányzik a pBR322 plazmidban rendelkezésre álló EcoRI hasítási hely. Ebből — Hindlll-mal és BamHI-vel végzett kezeléssel — eltávolítunk egy 0,18 milliárd molekulasúlyú, a szaporolás és a szelekció szempontjából szükségtelen rész-fragmentumot és ezt a pSB47 plazmidból származó, a foszfatáz gént tartalmazó szub-fragmentummal helyettesítjük. Ily módon a pSB53 foszfatáz plazmidot kapjuk. A pSB47 plazmidhoz hasonló módon állítható elő egy további plazmid, a pSB50 jelű. A különbség mindössze az, hogy kiindulási vektorként a pWB2 vektort alkalmazzuk, amelyet az E. coli-ból származó kromoszóma-DNS-sel együtt a HindlII restrikciós endo-5 nukleázzal reagáltatunk. Az így kapott pSB50 plazmidot tartalmazó baktérium törzsek ugyanúgy, mint a pSB47 plazmidot tartalmazók, lúgos foszfatázt termelnek. 5 A találmány tárgya egyben eljárás új baktérium törzsek előállítására, amely abban áll, hogy a szóbanforgó baktérium törzs kompetens sejtjeit a foszfatáz-plazmidokkal transzformációs körülmények között önmagában 10 ismert módon inkubáljuk és a kapott sejt-populációból elkülönítjük az antibiotikum-rezisztens sejteket. Az így kapott baktérium törzsekkel, amelyek plazmidjaikban lúgos foszfatáz géneket tartalmaznak, nagyobb mennyi- 15 ségű lúgos foszfatáz állítható elő, mint korábban. A törzseket ezután minimális foszfatáz-tartalmú táptalajban tenyésztjük és a képződött foszfatázt önmagában ismert módon elkülönítjük. Ily módon állítunk elő lúgos foszfa- 20 tázt pl. S. marcescens-ből és E. coli-ból. A S. marcescens lúgos foszfatázát pl. E. coli SB44 segítségével állíthatjuk elő. A következő táblázatban a lúgos foszfatáz koncentrációkat — egység/ml tenyészfo- 25 lyadék értékekben kifejezve —, amelyeket különböző, foszfatáz plazmidokat tartalmazó törzsek, valamint a megfelelő (kromoszóma foszfatáz gént tartalmazó vagy nem tartalmazó) kontroll törzsek esetében olyan körül- 30 menyek között kaptunk, amelyek a lúgos foszfatáz képződését lehetőleg erősen stimulálják (a közeg alacsony foszfát-tartalma következtében lép fel az indukció). Minden esetben bebizonyosodott, hogy egy foszfatáz plazmid 35 jelenléte a foszfatáz koncentráció jelentős emelkedését eredményezte; maximálisan a csak 1 kromoszóma foszfatáz gént tartalmazó törzsekkel kapott értékek 11-szerese volt elérhető. Ez vonatkozik a S. marcescens-re is, 40 mint olyan gazdasejtre, amely E. coli plazmidokat képes felvenni. A J. Bacteriol. 120., 970—973., 1974 helyéről ismert, E. coli foszfatáz gént tartalmazó plazmid sejtenként csak 1—2 példányig ban, a találmány szerinti plazmidok ezzel ■ szemben maximálisan sejtenként 20 példányban fordulnak elő. 6 Táblázat phoA plazmidokat tartalmazó baktériumok foszfatáz termelése* Gazdasejt ] plazmid a plazmidban jelenfoszfatáz levő phoA gén eredete aktivitás E. coli SB44 /phoA mutáns/-0 pSB47 E. coLi U,0 pSB50 ” 12,5 pSB51 " 20,0 pSB5 1 S. marcescens 19,5 PSB60 ti. coli 20,1 E. coli HB101 pWB2 pTioA gén nélkUli vektor 5,0++ p SB4 7 E. coli 18,0 pSB50 " 13,0 E. coli K12 /vad típus/-2,5 pSB47 K. coli 11,0 pSl’,50 " ^ 13,6 p SB51 S. marcescens 19,5 S. marcescens /vad típus/-4,1 pSB51 S. marcescens 44,0 PSB53 K. coli 19,6 4
