193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
A találmány tárgya eljárás olyan baktériumtörzsek előállítására, amelyek az azonos — vagy akár egy idegen faj lúgos foszfatázát (a megfelelő vad típusra vonatkoztatva) igen magas kitermeléssel képezik és ezért különösen alkalmasak ennek az enzimnek fermentációs úton való termelésére. Lúgos foszfatázok baktériumokból való előállítására már ismeretesek eljárások, a „The Enzymes. Ed. P.D. Boyer, Acad. Press 1971, Vol. IV., 373 —415." monográfiából. így pl. ismert egy E. coli foszfatáz gént tartalmazó plazmid; ennek esetében egy F’ faktorról van szó, amely egy fertilitási tényező és egy kromoszóma-DNS szakasz in vivo rekombinációjával keletkezett E. coli-ban (M. Bracha, E. Yagil, J. Bacteriol. 120, 970— 973, 1974). Ilyen plazmid elkülönítését mindeddig csak az E. coli foszfatáz gén esetében írták le, ezért ez nem jelent általános alkalmazható eljárást foszfatáz gének klónozására. Ily módon nem lehet pl. egészen különböző eredetű, pl. alacsonyabbrendű Eukaryotákból származó géneket klónozni. Az F’13 plazmid, mint sok más fertilitási tényező, sejtenként csak 1—2 példányban fordul elő, ennek következtében a foszfatáz-képződés csupán kismértékű fokozása érhető el. A lúgos foszfatázok (EC3.1.3.1) olyan enzimek, amelyeket számos prokarióta és eukarióta szervezet előállít és amelyek a legkülönbözőbb foszforsav-monoésztereket szervetlen foszfáttá és a megfelelő alkoholokká tudják hidrolizálni (I. T.W.Reid és I.B. Wilson öszszefoglalását a következő helyen: The Enzymes, Ed. P.D.Boyer, Acad.Press 1971., Vol. IV., p. 373—415. Ezeket az enzimeket a biokémiában és a molekuláris biológiai kutatásban, valamint a klinikai diagnosztikában alkalmazzák preparatív és analitikai reagensként. A 26 17 350 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat hordozón rögzített lúgos foszfatázt ismertet, amely meghatározott oligonukleotidek előállítására használható. A foszforsav-monoészterek kvantitatív meghatározása úgy végezhető, hogy mérik a lúgos foszfatázzal végzett hidrolízis során keletkezett szervetlen foszfát mennyiségét (Acta Chem. Scand. B31, 125—129, 1977). Fontos alkalmazási terület a különböző enzim-immuntesztekben könnyen kimutatható jelző enzimként való felhasználás, amelynek során a lúgos foszfatáz a meghatározás jellegétől függően akár egy antigénhez, akár egy antitesthez hozzákapcsolható. Az enzim-immuntesztek számos anyag (hormonok, vírus-fehérjék, a legkülönbözőbb sejtfal-antigének, antitestek stb.) igen kis mennyiségekben való specifikus és kvantitatív meghatározását teszik lehetővé). E. Engvall, A.J. Pesce, Quantitative Enzyme Immunoassay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978). Számos ilyen alkalmazási területen kitüntetetten alkalmazzák az E. coli-ból származó lúgos foszfatázt, és ebben — egyebek kö1 2 zött — szerepe van annak is, hogy ennek az enzimnek, az emlősökből származó foszfatázokhoz képest, előnyösen magas a hőstabilítása (20 perc 85°C-on) (J5 2099—211 sz. japán szabadalmi leírás). Számos baktérium, különösen az E. coli, egyes enzimeket erősen megnövekedett menynyiségben szintetizál, ha a megfelelő génből (amelyből a vad típusú baktériumokban sejtenként rendszerint csak 1 található) sejtenként több példány fordul elő (I.G. Young és társai, Gene 4, 25—36, 1978). Ez a magas gén-szám (kb. 10—20 db/sejt) azáltal érhető el, hogy a DNS in vitro rekombinációjához megfelelő megoldások segítségével a megfelelő gént hordozó DNS-fragmentumokat szelektive átvisszük baktériumokra. Gének baktériumokra való célzott átvitelével kapcsolatban — amely átvitel DNS-klónozásnak is nevezhető — különböző eljárásokat ír le K.N. Timmis, S.N. Cohen. F.C. Caballo a következő helyen: Progress in Molecular and Subcellular Biology, F.E. Hahn ed., Vol. 6., p. 1—58, Springer Verlag 1978. Valamennyi ilyen eljárás alapja az, hogy egy, a megfelelő gént hordozó DNS-fragmentumot egy megfelelő vektor-DNS-sel kapcsolunk öszsze, ilyen formában beviszünk egy megfelelő befogadó sejtbe és ebben mint rekombinált DNS-t szaporítjuk. Vektorként plazmidok vagy baktériumfágok alkalmazhatók. A plazmidok gyűrűalakú, kétágú DNS-ből álló molekulák, amelyek sok baktériumtörzsben megtalálhatók és a baktériumokban a kromoszóma-DNS-től függetlenül (a kromoszómán kívül) szaporodni képesek. A DNS-klónozás elősegítésében lényeges szerep jut a restrikciós endonukleázoknak, amelyek a kétágú DNS-molekulát pontosan meghatározott helyeken kisebb fragmentumokká tudják felhasítani. Az anyagcsere-enzimek génjeit hordozó DNS-fragmentumok klónozására egy gyakran alkalmazott eljárás pl. abból áll, hogy egy megfelelő donor szervezet kromoszóma-DNS- ét és egy plazmid-DNS-t egy megfelelő restrikciós endonukleázzal reagáltatunk, DNS-ligázzal való összekeverés után. Ennek során a DNS-fragmentumokból sok különböző lineáris és körkörös oligomer termék — többek között gyűrűalakú molekulák is — keletkezik, amelyek plazmid-molekulaként 1 molekula, a kívánt gént tartalmazó DNS-fragmentumot foglalnak magukba. A DNS-keveréket ezután, egy transzformációnak nevezett eljárás keretében átvisszük megfelelő befogadó baktériumokra és a teljes sejt-populációból kiválasztjuk azokat a sejteket, amelyek a keresett plazmid-DNS rekombinánst tartalmazzák. Ennek az eljárásnak a változatai azon alapulnak, hogy a kromoszóma-DNS felhasítását nyíróerő (ultrahang stb.) alkalmazásával érjük el és hogy a plazmiddal való összekapcsolás kopolimer egyágú DNS segítségével történik (L. Clarké és J. Carbon, Proc. Nat. Acad.Sei.) USA (72, 2 193504 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
