193472. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi leukocita interferon tisztítására
A találmány a biokémia területére vonatkozik és tárgya eljárás az emberi leukocita interferon tisztítására. Az emberi leukocita interferon tisztítására ismert egy eljárás (Cantell K .Hirvonen S., Interferon System, A’Current Review to 1978, Ed. S. Baron, F. Dianzani, I977, Nr, 35, S. 138), amelyben a fehérjét kálium-tiocianát oldattal kicsapják, a fehérjecsapadékot elválasztják és a végterméket savas közegben etanollal többfokozatú extrakcióval izolálják. Ezzel az eljárással 106 lE/mg fehérje specifikus aktivitású végterméket állítanak elő. Azonban az eljárás nagyipari méretekben történő alkalmazását rendkívül megnehezíti, hogy a végterméket a megadott specifikus aktivitással csak 0,01 pontosságú pH értékű közeg betartásával lehetséges előállítani. Ezen kívül ez az eljárás rendkívül munkaigényes is, ugyanis savas közegben hétfokozatú etanolcs extrakció szükséges. Ismert másik eljárás az emberi leukocita interferon tisztítására is (C B. Anfinsen, Proc Nat, Acad. Sei., „The process of making interferon”, 1974,71, 3139), amelyben a natív fehérjét ammónium-szulfáttal kicsapják, a fehérje csapadékot elválasztják, az elválasztott csapadékot feloldják és a végterméket gélszüréssel állítják elő. Ezzel az eljárással azonban nem valósítható meg nagy kitermelés és nagy tisztaság, amely arra vezethető vissza, hogy az interferon a gél - szűrés során a nehéz fehérjékkel aggregálódik. A találmányunk célja, hogy olyan eljárást valósítsunk meg az emberi leukocita interferon tisztítására, amelyben a gélszürés feltételeit úgy választhatjuk meg, hogy a végtermék kitermelése és tisztasága is fokozódjék. A feladatot úgy oldottuk meg, hogy az emberi leukocita interferon tisztítására szolgáló eljárásban a natív fehérjét ammónium-szulfáttal kicsaptuk, a fehérje csapadékot elválasztottuk, az elválasztott csapadékot feloldottuk és a végterméket gélszűressel előállítottuk A találmány szerinti eljárásban a csapadékot egy 2,5-9,0 pH-jú, 1,0-8,0 mól/l koncentrációjú dezaggregáló reagenst tartalmazó pufferban feloldottuk és gélszürés előtt ugyanennek a puffernak 3- 5% kolonna térfogatnyi mennyiségét a kolonnára felvittük. A végtermék kitermelését és tisztasági fokát növelhetjük, azáltal, hogy a csapadék feloldását és a végtermék gélszűrését dezaggregáló reagens jelenlétében folytatjuk le, amely a fehérjekomplexek szétzúzását segíti (Sbornik Statej, Sovremennije problemi biokhimii, Moszkva, 1961). A 9,0 pH feletti és a 2,5 pH alatti közegekben az interferon nem stabil. Abban az esetben, ha gélszürés előtt a fehérje feloldására szolgáló puffert a kolonna térfogat 3% alatti mennyiségében visszük fel a kolonnára, akkor a gélszürés során a fehérjekomplex részleges redukciója történik, amely a végtermék veszteségét és a végtermék tiszta1 sági fokának csökkenését okozza. Ha a kolonnára felvitt puffer mennyisége a kolonnatérfogat 5%-a felett van, akkor a dezaggregáló reagens a végtermékben kimutatható. Célszerű dezaggregáló reagensként karbamidot alkalmazni, amelynek a pufferben mért koncentrációja 2-8 mól/l. Ha a pufferban a karbamidtartalom 2,0 mól/l alatt van, akkor nem megy végbe teljes mértékben a fehérjekomplex szétzúzása, amely a végtermék kitermelésének és tisztaságának csökkenését okozza Ha a pufferban a karbamid tartalom 8,0 mól/l felett van, akkor a karbamid kicsapódik. A találmány szerinti eljárás egy másik kivitelezési formájában dezaggregáló szerként guanidin-kloridot alkalmazunk, amelynek a pufferban mért koncentrációja 1,0-6,0 mól/l. Ha a pufferban a guanidin-klorid tartalom 1.0 mól/l alatt van, akkor nem megy végbe teljes mértékben a fehérjekomplex szétzúzása, amely a végtermék kitermelésének és tisztaságának csökkenését okozza Ha a pufferban a guanidin-klorid tartalom 6.0 mól/l felett van, akkor a guanidin-klorid kicsapódik. A találmány szerinti eljárást a következő módon folytatjuk le: A telítésnek legalább 70%-áig ammónium-szulfátot adunk a natív interferonhoz, miközben a leukocita interferon és egyéb fehérjék kicsapódnak, A csapadékot centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot dezaggregálószert tartalmazó 2,5 9,0 pH érté kű, 0,1 mól/l-es pufferoldatban feloldjuk. Az így előállított fehérjeoldat gélszűrése előtt ugyanennek a dezaggregáló reagenst tartalmazó puffernek 3-5% kolonna térfogatnyi mennyiségét a gélkolonnára juttatjuk A gélszűréssel az 5-70 kD molekula tömegű fehérjék elválasztását valósítjuk meg. Célként ultragélt vagy egyéb gélfajtát alkalmazunk, miközben arra ügyelünk, hogy a dezaggregáló szer hatásával szemben a gél viszonylag stabil legyen és lehetőséget nyújtson az 5-70 kD molekulatömegű fehérjék effektiv elválasztására. Az interferont a kolonnáról egy 2,5-9,0 pH- jú 0,1-0,2 molaritású puffer oldattal eluáljuk. A pufferoldatnak és a gélkolonnának a dezaggregáló reagenstartalmát az alkalmazandó nyersanyag sajátosságainak megfelelően választjuk meg. 1. példa 8810 ml natív interferonhoz (2000 lE/ml, 2 mg/ml fehérje) hozzáadunk 4405 g ammónium-szulfátot A kicsapódó fehérjét centrifugálással elválasztjuk. Az elválasztott fehérje csapadékot 2,5 pH-jú , 0,1 mól/l-es foszfát-pufferben feloldjuk, az oldat 8,0 mól/l karbamidot tartalmaz. Az ultragéllel feltöltött kolonnát (K 100/100) egyensúlyba hozzuk egy 2,5 pH-jú 0,1 mól/l-es foszfát-pufferral, a kolonnára felvisszük ugyanebben a pufferban készített 2 193472 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
