193398. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers vinblasztin szulfát kromatográfiás tisztítására
A találmány tárgya eljárás legalább 30% vinblasztin-szulfát szilikagél-oszlopon történő kromatográfiás tisztítására. Ismert, hogy a vincaleukoblastin, vinblasztin, (rövidítve a továbbiakban VLB) több évtizede használt citosztatikum, mely többek között akut leukémia gyógyításában hatékony. Ismert az is, hogy a rózsameténg (Catharantus roseus) nevű növényben a VLB mellett csaknem 100 egyéb alkaloidot írtak le, melyek közül számos szerkezeti analóg is megtalálható. A jelenlévő alkaloidok nagyfokú szerkezeti hasonlósága és az aránylag alacsony koncentráció miatt a drogból való tiszta VLB kinyerése nem könnyű feladat. Az utóbbi két évtizedben több eljárást dolgoztak ki a VLB eredményes elkülönítésére, amelyek mind a szárított drog savas vagy bázisos előkezelésén és szerves oldószer alkalmazásával történő kivonatolásán, a vizes oldatba vitt alkaloidok különböző pH-értékeken történő tisztításán és szerves oldószerbe átoldott alkaloid-elegy kromatográfiás frakcionálásán alapulnak. A kromatográfiás szétválasztás során a legnagyobb nehézségeket a szerkezetileg igen hasonló vinblasztin, vinkrisztin/rövidítve a továbbiakban VCR/, N-dezmetil-VLB, dezacetoxi-VLB, leurozin és anhidro-VLB hatékony, kevés lépésben történő elválasztása jelentette. A szakirodalomban számos próbálkozást ismertettek a vinblasztin ún. „finomtisztítására", melyet oszlopkromatográfiásan végeztek. A 153 200 és a 154 715 sz. magyar szabadalmi leírások szerint az oszlopkromatográfiához különböző aktivitású alumínium-oxidtöltetet és kloroform-benzol (etanol) -oldószer-elegyet használnak. A módszer alkalmas ugyan a VLB és VCR egymástól való elválasztására, de nem használható a VLB-nak leurozintól, valamint a dezacetoxi-vinblasztintól történő hatékony eltávolítására. További fejlesztést jelentett a 172 708 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti előtisztítás, melynek értelmében 50-60% vinblasztin-tartalmú szulfát-sót lehet az ún. „ puíferolásos módszerrel" előállítani. Ez benzolos oldatból való vizes foszfát-puffer-oldattal (pH=4±0,l értéken) való kivonatolást jelent. Az így előtisztított VLB-bázis sem alkamas a legkorszerűbb gyógyszerkönyvi előírások kielégítésére. Ugyancsak említésre érdemes a 164 958 sz. magyar szabadalmi leírás, amely szerint az alkaloidelegyben jelenlévő N-dezmetil-vinblasztin formilezéssel vinkrisztinné alakítható, így a vinblasztin elválasztás szempontjából eggyel kevesebb szennyezéssel lehet számolni. A kapott termék tisztasága még így sem megfelelő. összefoglalva tehát megállapítható, hogy a jelenleg publikált eljárások egyike sem alkalmas a korszerű követelményeknek megfelelő — azaz összesen 5%-nál kisebb egyéb szennyezést tartalmazó — VLB-szulfát előállítására. 2 1 A találmány célja tehát olyan eljárás kidolgozása, mellyel a lehető legegyszerűbb módon, magasfokú VLB hasznosítással, a legszigorúbb gyógyszerkönyveknek megfelelő minőségű vinblasztin nyerhető. A fenti cél elérése érdekében az alkaloidok kromatográfiás elválasztására végeztünk kísérleteket. Kísérleteinkben igen nagyszámú, különböző szerves és Szervetlen sókat és esetenként szerves oldószert is tartalmazó puffer-oldatokat próbáltunk ki különböző töltetű kromatográfiás oszlopokon. Törekedtünk arra, hogy a VLB-t és egyéb alkaloidokat lehetőleg sólormában tisztítsuk, elkerülve az anyag bázis formában való jelentősebb mérvű bomlását, valamint az oszlopra kristályosodást. Meglepő módon azt találtuk, hogy egy speciális összetételű eluáló rendszer, nevezetesen egy piridin-ecetsav-víz-etilacetát elegy különböző összetételei, valamint egy piridin-ecetsav-víz-aceton elegy különböző összetételei alkalmasak az alkaloid-elegy frakcionálására. Mivel a két rendszer alkalmazására gyakorlatilag ekvivalens, ezért a példákban csak az egyszerűbb feldolgozást biztosító etilacetátot tartalmazó rendszerrel foglalkozunk. Kísérleti munkánk során megállapítottuk, hogy az alkalmazott rendszerben — elsősorban a bázikus karakterű piridin jelenléte miatt — a VLB különösen bomlékony. Azt találtuk, hogy a bomlás kiküszöbölhető savanyú pH biztosításával. A pH az elválasztás hatékonyságát is nagymértékben befolyásolja. Legelőnyösebbnek a pH 4-5,5 közötti rendszereket találtuk, mely rendszerekben a piridin csak acetát formában fordul elő. Találmányunk lényege tehát az, hogy piridin-acetát- (ecetsav) -víz-etilacetát-szilikagél rendszeren olyan kétfázisú folyadék-rendszert hozzunk létre /álló-mozgó fázist/, mely rendszerek pH-ja és polaritása különböző, majd a két fázis között az anyagot megoszlatva oszlopkromatográfia segítségével egy lépésben használjuk ki a komponensek elválasztására a polaritás- és bázicitás-beli különbségeket. A fentiek alapján a találmány: eljárás legalább 30% vinblasztint tartalmazó nyers vinblasztin-szulfát szilikagél-oszlopon történő kromatográfiás tisztítására, úgy, hogy a kromatográfiás elúciót 70-90 térfogatrésznyi etilacetát vagy aceton és 10-30 térfogatrésznyi pH=4-5,5 értékű 1:0,4-2,5:0,2-0,55 térfogatarányú piridin-ecetsav-víz rendszerek elegyeivel végezzük, majd a kapott alkaloid-só (ka ) t tartalmazó frakciókat 1:1-10:1, előnyösen 3:1 térfogatarányban vízzel hígítjuk, a kapott szerves fázist elválasztjuk, a tiszta vinblasztin-szulfátot ismert módon izoláljuk. Az oszlopkromatográfiához használt piri din-ecetsav-víz-rendszerként tehát 1:0,4-2,5: :0,2-0,55 térfogatarányú, ezen belül előnyösen 1:0,715:0,55 térfogatarányú rendszert használunk. Az etilacetáttal kiegészített rendszer összetétele a megadott értékek között változ2 193398 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
