193373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos 9'-tiapeptid-ergotalkaloidok előállítására
193373 7 8 Ezt a tenyészetet 24°C-on körrázógépen inkubáljuk (180 perc"1, 5 cm-es kör). 4 nap inkubációs idő után minden egyes tenyészethez 90 mg L-tiazolidin-4-karbonsavat adunk. A tenyészeteket ezután még 10 napig inku- 5 báljuk a körrázógépen. A fermentáció befejeződése után a tenyészeteket leszűrjük. A micéliumtömeget kíméletesen megszárítjuk. A főtenyészetből származó micéliumtömeg száraz súlya 85 g/liter. Az alkaloida- 10 tartalom: 12 mg/g. A 9’-tia-ergotamin és a 9’-tia-ergotaminin összmennyisége az összalkaloidtartalom 10%-a. 2. A cím szerinti vegyületek elkülönítése 500 g száraz micéliumtömeget Ultra-Tur- 15 rax készüléken 1600—1600 ml metanol -f- 2% ammóniaoldat eleggyel kétszer, majd 1200— 1200 ml metanollal kétszer homogenizálunk úgy, hogy minden egyes homogenizálás öt percig tartson, és az egyesített szűrletet leg- 20 feljebb 40°C-os fürdőhőmérsékleten, vákuumban bepároljuk (körülbelül 50 g borvörös bepárlási maradék). Ezt a bepárlási maradékot 500 ml metanolban oldjuk, és az oldatot 10 cm2 keresztmetszetű kromatográfiás cső- 25 ben elhelyezett 500 g II. aktivitásfokú alumínium-oxidon (Woelm) át szűrjük, 2000 ml metanollal mossuk, és az egyesített szűrletet vákuumban szárazra pároljuk (25 g sárga hab). Ezt a bepárlási maradékot 200-szoros 30 mennyiségű Kieselgel 60-on (Merck), diklór-metán + 2% metanol futtatóval kromatográfiásan szétválasztjuk. Az egyes frakciók bepárlási maradékait vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk, és egyesítjük azokat a frak- 35 ciókat, amelyek csak a 9’-tia-ergotaminnak megfelelő foltot mutatják (Rf értékek az 1. táblázatban). 9’-Tia-ergotamin Azokat a frakciókat, amelyek a vékonyrétegkromatográfiás analízis szerint fy értéküknek megfelelően csak 9’-tia-ergotamint tartalmaznak, etil-acetátban oldjuk, az oldatot talkumrétegen át tisztára szűrjük, vákuumban betöményítjük, kevés hexánt adunk hozzá, mire az alkaloida kikristályosodik. Ugyanabból az oldószerből való átkristályosítássa! fehéres-sárgás színű tiszta kristályokat nyerünk. Olvadáspontja: 199°C-tól lassú bomlás; [a]£° =—165° (c = 0,5, kloroformban) 9’-Tia-ergotamin-metánszulíonát 180 mg 9’-Tia-ergotamint kevés etanolban oldunk, és az oldathoz hozzáadjuk 29 mg metánszulíonsavnak alkoholos oldatát, mire az alkaloida metánszulfonátként kikristályosodik. Metanolból való átkristályosítás után tiszta fehér sót kapunk. Olvadáspontja: 211 °C-tól bomlik; [a]20 = = +76° (c = 0,51, metanolban) 9’-Tia-ergotaminin Azokat a kromatográfiás frakciókat, amelyek vékonyrétegkromatográfiásan a megfelelő Rf érték (lásd 1. táblázatot) mellett egy foltot adnak, etil-acetátban oldjuk, az oldatokat egyesítjük, és talkumrétegen át tisztára szűrjük. A koncentrált oldathoz kevés hexánt adunk, mire az alkaloida fehér kristályok formájában kiválik. Ugyanebből az oldószerből átkristályosítva kapjuk a tiszta vegyületet. Olvadáspontja: 199°C-tól bomlik; [a]20 = = + 343° (c = 0,55, kloroformban) •1. Táblázat a vékonyrétegkromatográfiás R^ értékeket mutatja, az ergotaminnal /Et/ és az ergotamininnel /Et-in/ összehasonlítva Réteg és futtatószer Tia-Et Er Tia-Et-in Et-in Alox ^ Etil-acetát/szék. butanol 9:1 0,44 0,34 0,68 0,59 Toluol/izopropanol 9:1 0,58 0,50 0,69 0,63 Toluol/izopropanol 19:1 0,30 0,24 0,58 0,46 • 2/ Kieselgel Toluol/izopropanol 85:15 0,15 0,11 0,43 0,31 Diklór-metán/metanol 93:7 0,25 0,22 0,65 0,52 ^ Alumínium-oxid - Fertigplatten Merck F 254 /Typ E/ 2/ Kieselgel - Fertigplatten Merck F 254 A vékonyrétegkromatogramon a foltok UV fényben 254 nm-nél kékesibolya, 366 nm-nél pedig világoskék színűek. Ha a kromatogramot jódgőzzel hívjuk elő, a foltok barna színűek. A tipikusan az ergotalkaloidokhoz való van Urk-reagens kiválónak bizonyult a foltok előhívására. A kromatogramot ezzel a reagenssel bepermetezve a foltok kékesibolya színűek, és ez a szín napfény vagy leheletnyi királyvízgőz hatására megerősödik. 2. példa 9’-Tia-ergokrisztin és 9’-tia-ergokrisztinin 1. Az NRRL 12044 jelű törzs tenyésztése Az NRRL 12044 jelű törzset az 1. példával analóg módon tenyésztjük. A főtenyészet migQ céliumtömegének száraz súlya 80 g/liter. Az alkaloidatartalom 10 mg/kg. A cím szerinti vegyületek összmennyisége az összalkaloidtartalom 8%-a. 2. A cím szerinti vegyületek elkülönítése 500 g száraz micéliumtömeget Ultratur- 65 rax készüléken 1500—1500 ml metanol + 2% 5
