193303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbamidszármazékok előállítására
tást és ez ugyancsak hozzájárulhat például a vegyületek antihipertenzív hatásához, anélkül azonban, hogy ortosztatikus hipotóniát okoznának, ami egyébként rendszerint fel szokott lépni. A fenti farmakológiai tulajdonságokat in vitro vagy in vivo lehet kimutatni és ennek során kísérleti alanyként előnyösen emlősállatokat, mint pl. patkányokat, macskákat, kutyákat, vagy ezekből izolált szerveket használunk. Az állatok tenziója lehet normális vagy magas, így például használhatunk genetikailag hipertóniás patkányokat, vagy pedig renálisan hipertóniás patkányokat vagy kutyákat, illetőleg olyan kutyákat, melyektől a nátriumot megvontuk. A találmány szerinti vegyületeket enterálisan vagy parenterálisan lehet beadni; az orális és az intravénás beadás előnyös. Az alkalmazás például zselatinkapszulák vagy keményítőtartalmú szuszpenziók, illetőleg vizes oldatok alakjában történhet. Az alkalmazott dózis kb. 0,01-100 mg/ /kg/nap, előnyösen kb. 0,05-50 mg/kg/nap és különösen előnyösen kb. 0,1-30 mg/kg/nap határok között lehet. A vérnyomáscsökkentő hatást in vivo vagy közvetlenül mérjük a kísérleti kutya combverőerébe (artéria femoralis) vezetett katéter segítségével, vagy indirekt módon szfigmomanométerrel mérjük a kísérleti patkány farkán és mindkét esetben megfelelő berendezéssel regisztráljuk. A Hg mm-ben kifejezett vérnyomást a hatóanyag alkalmazása előtt és után meghatározzuk. így pl. a jelen találmányra leginkább jellemző vegyületek, melyeket a példákban ismertetünk, magas vérnyomású patkányokon vagy kutyákon már orálisan alkalmazott 10 mg/kg/nap vagy ennél alacsonyabb dózisban igen hatásosak. Az antihipertenzív hatást és a szívfrekvencia csökkenését spontán hipertóniás patkányokon lehet kimutatni, ha a szisztolés nyomást a patkány farkán indirekt módszerekkel, így szfignomanométer segítségével mérjük. Az ébren levő patkányokat egymástól elkülönítve olyan ketrecekbe zárjuk, melyek kellemesen meleg térben vannak elhelyezve. A vérnyomás és a szívfrekvencia kontrollértékének meghatározása után a kísérleti vegyületet két vagy négy egymást követő napon és naponta egyszer orálisan beadjuk az állatnak. A vérnyomást rendszerint az első dózis beadása után 24 órával, majd ezt követően a mindenkori napi dózis után 2,0 , 4,0 és 24 órával megmérjük. A hatást a csak hordozóanyagot kapott patkányokon észlelt adatokkal hasonlítjuk össze. A vérnyomáscsökkentő és a bradikardiát előidéző hatást ugyancsak vizsgálni lehet ébren levő és krónikusan hipertóniás kutyákon, melyek hipertóniája a vesefunkciók gyengülésén alapszik. Az artériás vérnyomást az állatok combverőerének közvetlen perkután punkciója után mérjük, ennek során megfelelő regisztrálóberendezéshez kapcsolódó tűt alkalmazunk. A kontrollértékek meghatározása 3 után a kutyákat négy napon át naponta egy alkalommal orálisan beadott kapszulákkal kezeljük, ezek tartalmazzák a vizsgálni kívánt hatóanyagot. A vérnyomást és a szívfrekvenciát az egyes napi dózisok beadását követően mindig 1,5,3,6 és 24 óra múlva meghatározzuk és a kapott eredményeket a kezelés megkezdése előtt mért kontrollértékekkel hasonlítjuk össze. A szóban forgó új vegyületek azon tulajdonságát, hogy a ß-receptorokra kötődnek és így a ß-receptorokat befolyásoló, mint például azokat blokkoló hatás jön létre, egy ß-receptor-kötési teszttel in vitro határozzuk meg, a Life Sciences 17, 993 (1975) irodalmi helyen ismertetett eljárás égy módosított változatával. 3H-dihidroalprenololt agymembrán-preparátumon specifikusan megkötünk és ezt a;kölcsönhatást ß-receptorok ismert agonistá’ival és antagonistáival gátoljuk. A kötési teszt során a membránpreparátum szuszpenziójából 2 ml-es próbákat jéggel hűtött kémcsövekbe adagolunk, ezek tartalmazzák a 0,1%-os aszkorbinsavban frissen oldott 3H-dihidroalprenololt a tesztvegy él lettel együtt, vagy tesztvegyület nélkül (a membránpreparátum kb. 20 mg, borjúagyból származó nucleus caudatusnak felel meg). A 3H-dihidroalprenolol végkoncentrációja: 1,0 nmól. A tesztelni kívánt vegyületeket széles koncentrációtartományon belül vizsgáljuk. A kémcsövet 10 percig 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a szuszpenziókat vákuum alatt azonnal üvegszűrőn keresztül szűrjük. Az egyes szűrőket ezután 15 ml hideg 50 mmólos trisz-HCl-pufíerrel (pH = 7,9 , 25°C-on) átmossuk és a kapott folyadékokat 12 ml szcintillációs oldattal együtt szcintillációs ampullákba töltjük, melyeket előbb 90 percig tartó rázatásnak vetünk alá, majd a radioaktivitást számlálócső segítségével megmérjük. Az IC50-értékek a vizsgált vegyületek azon koncentrációit fejezik ki, amelyek az 1,0 nmólos 3H-dihidroalprenolol-oldat specifikus kötődésének 50%-os csökkentésére szükségesek. Ezeket az értékeket grafikusan határozzuk meg. A találmány szerinti vegyületek a dihidroalprenololnak a ß-receptorokon történő kötődését gátolják, mimellett az IC50-érték csupán 5 nmól (azaz 5 x 10 9 mól) vagy ennél is kevesebb. A találmány szerinti vegyületeknek ß-receptorokra kifejtett antagonisztikus hatását in vitro lehet kimutatni, tengerimalac kisagyából származó adenilátcikláz-preparátumnak az adrenalin aktiválódására gyakorolt antagonizmusa által [J. Neurochemistry, 22, 1031 (1974)]. Az a-receptorokon való kötődés olyan képesség, ami az a-receptorokra gyakorolt gátló hatás meglétére utal. Ezt in vitro például az a-blokkolóként ismert prazosin (3H-prazosin) patkányok előagyából készített szinaptoszomális membránpreparátumon történő kötődésnek gátlásával lehet kimutatni [lásd: Nau-3 4 1933Ö3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
