193294. lajstromszámú szabadalom • Kérődzők emésztését előnyösen befolyásoló készítmény
az állattenyésztésben és takarmányozásban szokásos vivőanyagok, hígító- és/vagy tartósítószerek mellett hatóanyagként legfeljebb 95 tömeg% mennyiségben egy vagy több a Streptococcus, Sarcina, Ruminococcus, Veillonella, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Succinivibrio, Lachnospira, Selenomonas, Anaerovibrio, Anaeroplasma, Borrelia, Butyrivibrio, Succinimonas és Peptóstfeptococcus nemzetséghez tartozó mikroorganizmus tenyészetet és/vagy az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MNG 00287, 00288 és 00289 számon letétbe helyezett törzs(ek) tenyészetét tartalmazza. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti készítmény hatóanyagát képező mikroorganizmusok előállítására, amely abban áll, hogy adott takarmánnyal etetett állatok bendőjéből mintát veszünk, a mintából izolált mikroorganizmusok anyagcseréjét in vitro és/vagy in vivo megvizsgáljuk és az előnyösen metabolizáló mikroorganizmusokat az adott t-akarmányt szénvagy nitrogénforrásként tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a növekvő sejtekbe szelekciót lehetővé tevő genetikai jelzést juttatunk, a genetikailag jelzett törzseket tenyésztjük, a tenyészeteket visszajuttatjuk az adott takarmányon tartott állatok bendőjébe, a bendőkből időközönként mintát veszünk és meghatározzuk a genetikailag jelzett mikroorganizmus sejtek számát, majd a legalább 60 napon át jelen lévő és az állat emésztését előnyösen befolyásoló törzseket elkülönít jüjk. A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy szénával, abrakkal vagy melasszal etetett állatok bendőjéből az oda műtéttel beépített fisztulán át mintákat veszünk, és a bendőbaktériumokat tartalmazó tenyészeteket nitrogénforrást, szénforrást, szervetlen sókat, bendőfolyadékot és agart (Bryant és Burkey, J. Dairy Sei., 36, 205 (1953) ) tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajon szélesztjük. A tenyészeteket anaerob körülmények között inkubáljuk, majd az elkülönülten növekvő telepeket hasonló összetételű táptalajokon izoláljuk és tenyésztjük. A kinőtt tenyészetekkel nitrogénforrást, szervetlen sókat,., bendőfolyadékot, továbbá szénforrásként szénát vagy cellulózt, illetve abrakot vagy melaszt tartalmazó folyékony halmazállapotú táptalajokat oltunk és anaerob körülmények között addig inkubálunk, míg a táptalajokban intenzív növekedés figyelhető meg. A széna (cellulóz), abrak (keményítő), illetve melasz (szacharóz) szénforráson növekedni képes sejteket a fenti összetételű— szénforrásként cellulózt, illetve az abrak és melasz jelenlétében kinőtt sejtek esetén glükózt vagy szacharózt tartalmazó—szilárd hálmazállapo-3 1ú táptalajon izoláljuk szélesztést és tenyésztést követően. Az így kapott tenyészeteket genetikailag jelezzük. Jelzésként használhatunk bármely olyan öröklődő genetikai markert, amely lehetővé teszi a jelölt mikroorganizmus kimutatását más egysejtűek között. A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket juttatunk be a kiválasztott sejtekbe. Ha a bendőben élő baktériumok egy adott antibiotikumra érzékenyek és az adott antibiotikumra rezisztenseket juttatunk közéjük, ez utóbbi mikroorganizmusok szaporodását és pusztulását könnyen nyomon követjük úgy, hogy a mintákat az adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon szélesztjük. Ebben az esetben csak a rezisztens sejtek fognak növekedni. A kiválasztott, cellulózon, abrakon, illetve melaszon növekedni képes tenyészetekbe transzformációval (Bergmans és munkatársai, J. Bacteriol., 146, 564 (1981)) bejuttatjuk a kana'micin és kloramfenikol antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó géneket hordozó plOll jelű plazmidot (Simon és munkatársai, Proc. of the 8th Nort American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitobe Press, (1983)). A plazmid DNS-t Escherichia coli sejtékből izoláltuk (Bimbóim és Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979)). A törzs MNG 262 sorszámon van letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében. Az antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket hordozó DNS transzformációját követően az előzőekben megadott összetételű, de kanamicinnel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajon szelektáljuk az új genetikai információt stabilan tartalmazó és kifejező sejteket. A rezisztens törzseket tároljuk. Az izolált és tárolt tenyészetekkel nitrogénforrást, szervetlen sókat, bendőfolyadékot és félszílárd konzisztenciát biztosító mennyiségű agart, továbbá szénforrásként cellulózt, illetve glükózt tartalmazó táptalajt oltunk, majd anaerob körülmények között inkubálunk kettő-hat napon át. A kinőtt tenyészeteket előzőleg egy napon át éheztetett juhok takarmányához keverjük, és az állatokkal megetetjük. Etetés előtt, majd azt követően naponként mintát veszünk a bendőből, a mintákat az előzőekben megadott összetételű és kanamicinnel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajokon szélesztjük és meghatározzuk a bendőben élő, antibiotikum érzékeny és rezisztens mikroorganizmus sejtek számát. Meghatározzuk továbbá a mikroorganizmusok metabolitikus folyamatai során a bendőben keletkező illózsírsavak minőségét és mennyiségét. Ismeretes,, hogy ezek egymáshoz viszonyított aránya befolyásolja a kérődző állatok takarmányhasznosítását (Eskeland és munkatársai, J. An. Sei., 33, 282 (1971) és Church és munkatársai, 4 3 193294 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
