193246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kiméra DNS előállítására
193246 szét határolják amennyire lehet megrövidítsük a plazmidot a DHFR gén 3’ végén Bal 31 nukleázzal kezeljük. Ezt követően egy Sal I linker fragmentumot építünk a DHFR gén 3’ végére. Azokat a plazmidokat amelyeknél deléciók jelentkeznek és Escherichia colinál még a trimethoprim [2,4-diamino-5- -(3, 4, 5-trimetoxibenzil)-pirimidin] antibiotikummal szemben is rezisztenciát okoznak, DNS szekvencia analízisnek vetjük alá. E plazmidok egyikét, a pJP91 plazmidot (2. d. ábra), amely a stop kodont a kódoló DNS öt bázispárjával együtt már nem tartalmazza, választjuk ki a további kezelés céljára. Azt a DNS szekvenciát, amely a DHFR gén 5’ végét határolja, megfelelő módon — mint azt a 3’ végre vonatkozóan az előbbiekben leírtuk — Bal 31 nukleázzal való kezeléssel megrövidítjük (2. ábra). A pJP91 plazmid Xho I/-Sal I fragmentumát izoláljuk, és ezt építjük be a vírus DNS-be. b) A Cauliflower-mozaik vírusnál a DHFR gén befogadására szolgáló hely gyanánt a Ca MV20-Bal I plazmidot (3.a. ábra) használjuk fel. Ez egy kiméra-CaMV plazmid, amely a természetes CM4-184 deletált mutánsból származik, és amelybe egy Xho I linker fragmentumot vezettünk be. Ebből a plazmidból az első öt kódon és a TFA transzlációs stopszignál kivételével, az egész II régió hiányzik. Egyetlen Xho I hasítási helyet tartalmaz, amely közvetlenül a stop kodon előtt, a II régióban található. A pJP91 plazmid izolált Xho I/Sal I fragmentumát beépítjük a pCaMV20-Bal 1 plazmid Xho I helyére, és így megkapjuk a pCaMV-NBl plazmidot (3. b. ábra), amely a DHFR gént a megfelelő irányítottsággal beépítve tartalmazza. Ez szabályozza az eredeti CaMV-DNS szignál szekvenciájának expresszióját (transzkripció és transzláció). 3. példa a) A pJP91 plazmidot Xho I enzimmel linearizáljuk és Bal 31 nukleázzal kezeljük az 5’ véget határoló szekvencia eltávolítása végett. Egy EcoR I linker beépítése révén, azoknál a réseknél, amelyek ATGG start kodonnal kezdődnek, Nco I restrikciós hely (CCATGG) keletkezik. Az ezeket a hasítási helyeket tartalmazó plazmidokat választjuk ki a további kezelés céljára (pNC4 plazmid; 2. e, ábra). Egy Nco I/Xho I adapter segítségével visszük be az Nco I helyre az Xho I helyet. így kapjuk a pNC4X plazmidot (2. f. ábra). b) A Cauliflower-mozaik vírusnál a DHFR gén befogadására a pCaMV20-Bal 1 plazmidot (3. a. ábra) használjuk, amelyből az ORF II régiót teljesen eltávolítottuk. Az így kapott pCaMV-BBl plazmid (3. c. ábra) építjük be a pNC4X plazmidból izolált Xho I/Sal I fragmentumot. A keletkezett vektorban, a CaMV-NB2 pazmidban (3. c. ábra), az I gén stop kodonja és a DHFR gén ATG 5 4 start kodonja közt csak 9 bázispár van, míg a 3’ vég felépítése ugyanaz, mint a pCaMV-NBI plazmidnál, azaz egy bázispár alkotja (3. ábra). 4. példa Brassica rapa fajhoz tartozó növényeket pCaMV-NBl vagy pCaMV-NB2 plazmidot tartalmazó vírussal oltunk be. Az ily módon oltott növényekből és a nem fertőzött növényekből levélcsíkokat teszünk a szokásos szilárd és folyékony táptalajokra, melyek különböző koncentrációban methotrexátot tartalmaznak. A levélcsíkokon a táptalajra való felvitelük utáni 4. napon jelentős különbségek látszanak. A 0,01 M methotrexát koncentrációtól kezdődően csak azoknak a levélcsíkoknak van normális külsejük, amelyeket pCaMV-NBl vagy pCaMV-NB2 vírussal fertőztünk. A nem fertőzött levélcsíkokon és azokon, amelyeket pCaMV20-Bal 1 vagy pCaMV-I3Bl vírussal fertőztünk, nekrotikus területek és színváltozások mutatkoznak. A levélcsíkoknak a táptalajokra történő rávitele utáni 6. napon a mikroszkópos vizsgálat szerint csak azon növények szöveteiben mutatható ki sejt növekedés és szaporodás, amelyeket pCaMV-NBl- vagy pCaMV-NB2 vírussal fertőztünk meg. 5. példa Az előző, 4. példában leírt, methotrexát tartalmú táptalajokban tenyésztett levélcsíkokat egy bizonyos idő elteltével methotrexát nélküli megfelelő táptalajra visszük át 0,01 — —0,02 M methotrexátot tartalmazó táptalajban való 24 órás tartás után a kontroll szövetek elhalnak. Ha a pCaMV-NBl- vagy pCaMV-NB2 vírussá oltott szöveteket viszszük át methotrexát nélküli táptalajba, akkor hegszövet (callus) képződik. 6. példa Két Brassica rapa fajú növényt pCaMV-NB1- vagy pCaMV20-Bal 1 vírussal fertőzünk és bepermetezzük 50 g methotrexát/m2 tartalmú 15 ml oldattal. A methotrexátos kezelés után egy hét múlva a pCaMV20-Bal I vírussal fertőzött. Kontrollként olyan Brassica rapa növények szolgálnak, amelyek egyáltalán nincsenek megfertőzve vagy a pCaMU20- Bal I, illetve pCaMŰ-BBl plazmidot tartalmazó vírusokkal fertőzöttek. Az ily módon oltott növényekből és a nem fertőzött növényekből levélcsíkokat teszünk a protoplasztkultúrák esetén a szokásos szilárd és folyékony táptalajokra, amelyek különböző koncentrációban methotrexátot tartalmaznak. Az ilyen táptalajok literenként körülbelül 10-néhány száz mg mennyiségben szervetlen ionokat (úgynevezett makroelemeket, például nitrát-, foszfát-, szulfát-, kálium-, magnézium-, vasiont), legfeljebb néhány mg mennyiségű egyéb szervetlen iont (úgy6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
