193246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kiméra DNS előállítására
193246 nevezett mikroelemeket, például kobalt-, cink-, réz- és mangáiont), továbbá vitaminokat (például inozitot, fólsavat, tiamint), energia- és szénforrásokat, például szacharózt vagy glükózt, valamint növekedésszabályozó anyagokat tartalmaznak, az auxinok és citokininek csoportjába tartozó természetes vagy szintetikus fitohormonok alakjában literenként 0,01 —10 mg mennyiségben. A táptalajokat ezenkívül cukcralkoholok (például mannit) vagy cukor (például glükóz) vagy sók (például kalcium-klorid) hozzáadásával ozmotikusán stabilizáljájk, és pH-jukat 5,6— —6,5-re állítják. Az ilyen táptalajokat például Koblitz, H. ismerteti a Methodische Aspekte der Zell- und Gewebezüchtigung bei Graminen unter besonderer Berücksichtigung der Getreide, Kultulpflanze, XXII. kötet, 1974., 93—157. oldalain. A levélcsikokon a táptalajra való felvitelük utáni 4. napon jelentős különböségek látszanak. A 0,01uM methotrexát koncentrációtól kezdődően csak azoknak a levélcsíkoknak van normális külsejük, amelyeket pCaMV-NB1 vagy pCaMV-NB2 vírussal fertőztünk. A nem fertőzött levélcsíkokon és azokon, amelyeket pCaMV20-Bal 1 vagy pCaMV-BBl vírussal fertőztünk, nekrotikus területek és színváltozások mutatkoznak. A levélcsikoknak a táptalajokra történő rávitele utáni 6. napon a mikroszkópos vizsgálat szerint csak azon növények szöveteiben mutatható ki sejtnövekedés és szaporodás .amelyeket pCaMV-NBl vagy pCaMV-NB2 vírussal fertőztünk meg. 5. példa Az előző, 4. példában leírt, methotrexát tartalmú táptalajokban tenyésztett levélcsíkokat egy bizonyos idő elteltével methotrexát nélküli, megfelelő táptalajra visszük át. Már 0,01—0,2 uM methotrexátot tartalmazó táptalajban való 24 órás tartás után elhalnak a kontroll szövetek, ha hethotrexát nélküli táptalajba visszük át őket, míg a pCaMV-NB1- vagy pCaMV-NB2 vírussal oltott szövetek hegszövetet (callus) képeznek. 6. példa Két-két Brassica rapa fajú növényt pCaMV-NB1 vagy pCaMV20-Bal 1 vírussal fertőzött növények majdnem teljesen elhalnak, míg a pCaMV-NBl vírussal fertőzött növényeken semmilyen károsodás nem látszik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás növényi vírus vírus-DNS-éből és egy növény-anyagban kifejeződő idegen génből álló kiméra DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy növényi vírus DNS-ébe növény-anyagban kifejeződő idegen gént építünk be oly módon, hogy egy vagy több olyan vírus DNS régiót, amelyek a kiméra DNS-t tartalmazó vírus szaporodásához 7 nem szükségesek, eltávolítunk, és az idegen gént a deléciós helyek egyikénéi beépítjük, miáltal ezzel egy vagy több eltávolított vírus DNS régiót pótolunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen gént a vírus DNS-ben olyan restrikciós enzim segítségével építjük be, amelyre nézve a virus DNS csak egyetlen restrikciós hasítási helyet tartalmaz, mégpedig úgy, hogy e restrikciós enzim felismerő szekvenciáinak a behelyezendő idegen gén mindkét végét határolniok kell. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azt a távolságot, amely közvetlenül a behelyezett gén előtt lévő vírus gén stop szignálja és a behelyezett gén start szignálja közt van, olyan rövidre veszszük, hogy a beépített idegen gén legnagyobb stabilitását és kifejeződését érjük el. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, a zzal jellemezve, . hogy a beépítendő gént határoló szekvenciákat egy nukleázzal távolítjuk el. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen stop szignálja és az idegen gént közvetlenül követő vírus gén start szignálja közti távolságot olyan rövidre vesszük, hogy a beépített idegen gén legnagyobb stabilitását és kifejeződését érjük el. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírus DNS-be olyan nagyságú idegen gént építünk be, amely az eltávolított vírus DNS fragmentum nagyságát, illetve az összes eltávolított vírus DNS fragmentum nagyságának összegét nem haladja meg annyira, hogy a kiméra DNS burkát gátolja. 7. Azl. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírus DNS-be egy vagy több kódoló régiót helyezünk be a vírus DNS leolvasási raszterének meghagyá sa mellett. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépítendő idegen gén végei nem homológok, és a gént a megfelelő irányítottsággal helyezzük be. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi vírusként egy DNS-vírust vagy egy vírus-RNS DNS másolatát használjuk. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Caulimorvírust használunk. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a karfiol-mozaik vj: rus eredeti vagy rekombinans törzseit használjuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eltávolítandó DNS régiót a következő csoportból választjuk ki: az ORF II egy vagy több területéből, az ORF VII-bői vagy a karfiol-mo-8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
