193246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kiméra DNS előállítására
193246 Caulimovírusok és speciálisan az eredeti karfiol vírus (CaMV) vagy ennek rekombináns törzsei felelnek meg. Az 1. ábra a kgrfipl-Wizaik vírus három különböző szerotípusának (CaMV S, CaMU 1841, CaMV DH) a géntérképét, valamint a hozzájuk tartozó restrikciós hasítási helyeket ábrázolja. A karfiol-mozaik vírusnak 6—8 nyílt leolvasás régiója (ORF) van, ezeket az 1. ábrán az I—VIII számokkal jelöltük. Mostanáig ezek közül az ORF-régiók közül háromhoz tudtak meghatározott funkciót rendelni (ORF VI, ORF IV és ORF II). így az ORF VI régió egy 62 000 molekulasúlyú olyan proteint kódol, amely a növények megfertőződése után képződő vírusos »záradéktest« fő szerkezeti proteinje. Az ORF IV régió a 42 000 molekulasúlyú fő bevonóproteint kódolja, és az ORF II termék esetén egy 18 000 molekulasúlyú olyan polipeptidről van szó, amely a karfiol-mozaik vírus levéltetvek által történő átvitelében játszik szerepet. A karafiol-mozaik vírusnál a vírus következő DNS régiói (kódoló régiók) távolíthatók el a szaporodási képesség csökkenése nélkül: ORF II, ORF VII és a genomok kö-' zötti régiók részei (1. ábra, a fehér szektorok a genomok közti régiókat jelzik). Különösen említésre méltó az ORF II régió eltávolítása, amely körülbelül 450 bázispárból áll és/vagy az ORF VII régióé, amely 350 bázispárt tartalmaz, mivel ennek ellenére a DNS fertőzőképessége mesterséges átoltáskor is megmarad. Különösen előnyösnek bizonyul, ha a vírus DNS tRNS kötőhelye és a leolvasási irányban következő ORF régió közt 50—70 bázispárnál nincs több, és a következő ORF régiók a lehető legrövidebb közönként következnek (a tRNS kötőhely a CaMV térképen a 0 helyzetnek felel meg, 1. ábra). A beépítendő idegen gént célszerűen az eltávolított ORF II helyére visszük be. A beépítendő gén különböző organizmusokból (származhat, például baktériumokból, Különösen alkalmas gén például a DHFR-gén (dihidrofolát-reduktáz gén). A beépítendő gént határoló szekvenciákat lehetőleg teljesen eltávolítjuk, előnyösen egy alkalmas enzim segítségével, például a Bal 31 nukleázzal. Amennyiben a kódoló szekvencia ATG star-t szignálja után egy újabb G következik, s ez átlagon felüli gyakoriságú, egy CC-vel végződő linker szekvenciával, közvetlenül a kódoló szekvencia 5’ végénél egy Nco I restrikciós helyet (CCATGG) viszünk be, amely linkerként használható. Ez a szekvencia a kiméra CaMV-vektor felépítéséhez szolgál. A kívánt molekula kiválasztása az Nco I szekvencia segítségével történik. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy segítségével a növények öröklött tulaj don -3 ságai egyszerű és hatásos módon, költséges és hosszantartó termesztési kísérletek nélkül megváltoztathatók, mégpedig úgy, hogy az öröklött tulajdonságok a kívánt célnak megfelelően változzanak. Ezenkívül az eljárás lehetővé teszi azt, hogy intakt növényekben idegen gének a teljes növényen belül szisztematikusan szétoszoljanak. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal világítjuk meg —anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét a példákra korlátoznánk —, amelyekben vírusként karafiol-mozaik vírust és idegen génként a plazmid-kódolta dihidrofolát-reduktáz gént (DHFR gént) alkalmazzuk. A DHFR gént a karfiol-mozaik vírus DNS-ébe építjük be, mégpedig az eltávolított ORF II régió helyére. A bevezetendő idegen gén — az R67 plazmád kódolója — a methotrexátra rezisztens DHFR enzim génje és 234 bázispárból áll. A folsav-antagonista methotrexáttal (4-amino-Nlö-metil-pteroil-glutaminsav) szembeni rezisztencia ki és megmutatkozik még a kiméra DNS-sel fertőzött növény methotrexáttal szembeni pontosan megállapítható rezisztenciájában. Az alant következő példákban leírt eljárásokat, amelyekben a CaMV DNS-ébe beépített DHFR logén szerepel idegen génként, más génekkel ugyanilyen módon, vagy olyan változtatásokkal, amelyek a szakemberek számára közismertek, véghez lehet vinni. Az alábbi 1. példában használt BamH I fragmentumot ismert módszerrel, például egy DHFR gén tartalmú plazmádnak — ilyen az R67 vagy az R388 — BamH I restrikciós enzimmel történő kezelése révén állíthatjuk elő. Az alábbi 1. példában szereplő pUC8X plazmidot a kereskedelemben kapható pUC8 plazmidból állíthatjuk elő úgy, hogy egy Xho I/EcoR I-adaptert csatolunk be az EcoR I helyre. A következő 2, példában szereplő, a DHFR gén befogadására szolgáló CaMV20-Bal I plazmidot a CM4-184 CaMV törzsből nyerjük úgy, hogy az ORF II helyet Bal 31 segítségével — ismert módon — eltávolítjuk, és a hasítási helyre egy Xho I linker fragmentumot vezetünk be. 1. példa Egy teljes DHFR gént tartalmazó BamH I fragmentumot (2. a. ábra) izolálunk és beépítjük a pUC8X plazmidba (2. b. ábra) amelybe a gén bevezetése előtt egy Xho I restrikciós helyet kapcsoltunk be a DHFR gén ezt követő befogadása érdekében. így kapjuk a pJP74 plazmidot (2. c. ábra). 2. példa a) A pJP74 plazmidot a Sal I enzimmel linearizáljuk. Hogy azokat a DNS szekvenciákat, amelyek a DHFR gén struktúrális ré4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
