193246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kiméra DNS előállítására
193246 1 A találmány olyan kiméra DNS előállítására vonatkozik, amely egy növény vírus vírus-DNS-éből és egy növény-anyagban kifejeződő idegen génből áll. Üj genetikai információnak növény-anyagba történő bevitele révén új vagy jobb tulajdonságú növényeket lehet létrehozni. A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amellyel a növények átöröklött tulajdonságai egyszerű módon megváltoztathatók. A világ népességének gyors növekedésére való tekintettel a haszonnövényeknek vagy növényi alkotórészt tartalmazó anyagoknak a termelése, főként az élelmiszerek és gyógyszerek területén, a biológiai kutatások legsürgősebb feladataihoz tartozik. Ebben az összefüggésben lényeges szempont például, ha növeljük a haszonnövényeknél a betegségekkel és kártevőkkel szembeni ellenállást. Ezt a növényben indukció révén vagy a védőanyagok, vagy toxinok képződésének megsokszorozása révén érhetjük el; a növényvédőszerekkel — ilyenek az inszekticidek, herbicídek, fungicidek és baktericidek — szembeni megnövekedett ellenállást és a növények tápanyag-tartalmának kedvező megváltozását értékes proteinek keletkezésének indukálása segítségével vagy más módon idézhetjük elő. Egy különleges vetülete e témának az, amikor a növény-any a got növény-idegen anyagok, azaz az eredeti növényben nem képződött anyagok előállítására késztetjük. A növény-anyag megfelelő befolyásolása például új, DNS bevitelével érhető el — itt kiméra DNS-ről is szó lehet — amikor is a növény-anyag sejt tenyészet formában, vagy mint a haszonnövény szaporító anyaga, vagy mint maga az egész növény is előfordulhat. Jelen találmány kiméra DNS előállítására vonatkozik, s lényege az, hogy egy növényi vírus DNS-ébe egy növényi-anyagban kifejeződő idegen gént ültetünk be. A találmány továbbá a kiméra DNS-nek a növény-anyag beoltására történő felhasználásra vonatkozik, azaz amikor vektorként egy kiméra DNS-t tartalmazó vírust viszünk be a növény-anyagba. A találmány ezenkívül vonatkozik még a kiméra DNS-t tartalmazó Cauliflower-mozaik vírusra, valamint egy ilyen vírussal fertőzött növény-anyagra is, továbbá a kiméra DNS felhasználására, azaz amikor ezzel növény-anyagot oltunk be úgy, hogy vektorként egy ilyen vírust alkalmazunk, valamint új plazmidokra. Jelen találmány kivitelezésénél célszerűen úgy járunk el, hogy a vírus DNS-ből egy vagy több régiót eltávolítunk, s itt csak azok a régiók jönnek számításba, amelyek a kiméra DNS-t hordozó vírus szaporodásához nem szükségesek. A megmaradt vírus DNS-be ezután egy idegen gént vezetünk be. Az idegen gént a vírus DNS egy megfelelő, az idegen gén expresszióját és a vírus szaporo-2 dási képességét nem befolyásoló régiójába építjük be. Előnyösen oda építjük be az idegen gént, ahonnan egy vírus DNS régiót eltávolítottunk (deléciós hely), s így a bekapcsolt idegen gén egy vagy több eltávolított vírus DNS régiót pótol. Ha több deléciós hely van jelen, akkor a vírus DNS-be több gént is be lehet vinni, s ilyenkor különösen előnyös, ha a gének egyike a növényben igen jól megállapíthatóan jut kifejeződésre, s ezáltal a kiméra DNS jelenlétének kimutatására alkalmazható. Általában előnyösnek bizonyul, ha az idegen gént a vírus DNS-be olyan restrikciós enzim segítségével visszük be, melyre nézve csak egyetlen restrikciós hely létezik, - ha a restrikciós enzim felismerő szekvenciái a beviendő idegen gént annak minikét végén határolják. Előnyös, ha közvetlenül a bevitt idegen gén előtt lévő vírus gén stop szignálja és a bevitt idegen gén start szignálja közti távolság a lehető legrövidebb. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli változata szerint a beviendő gént határoló szekvenciákat lehetőleg teljesen eltávolítjuk, célszerűen enzimatikus úton, például egy megfelelő nukleázzal. Hasznosnak bizonyul, ha a beépített idegen gén stop szignálja és az idegen gént közvetlenül követő vírus gén start szignálja közti távolságot a lehető legkisebbre veszszük. Igen előnyösnek bizonyul, ha olyan idegen gént építünk be, amelynek a nagysága az eltávolított vírus DNS fragmentum nagyságát vagy az összes eltávolítót vírus DNS fragmentum nagyságának összegét lényegesen nem haladja meg. Amennyiben jelen találmány szerint történik egy vagy több új kódoló régió bevezetése úgy a vírus DNS leolvasási rasztere megmarad. A bevezető idegen gén végei nem lehetnek homológok, és a megfelelő irányítottsággal kell beépíteni. A kiméra DNS-t amely ugyancsak a jelen találmány tárgyát képezi be lehet építeni növény-anyagba, például sejt tenyészetekbe vagy haszonnövények szaporító anyagába, vagy magába a teljes növénybe, ha vektorként a kiméra DNS-t tartalmazó, vírus DNS-spenderül szolgáló növényi vírust alkalmazzuk, ugyanakkor — jelen találmány szerinti eljárást alkalmazva — a beépített idegen gén kifejeződési képességét megtartja. Mint haszonnövények számításba jöhetnek különösen a következő növénycsaládok képviselői: Cruciferae (keresztesvirágúak), Leguminoses (hüvelyesek), Rosaceae (rózsafélék), Compositae (fészkesvirágzatúak), Solanaceae (burgonyafélék). Vírus-DNS spenderként. s egyszersmind vektorokként előnyösen DNS vírusok, vagy egy vírus-RNS DNS másolata, előnyösen a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
