193234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin és származékai előállítására
13 193234 14 n-butanollal extraháltuk. Az így nyert n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása céljából, és a desztillálási maradékot metanollal elegyítettük. Az elegyet leszűrtük az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából, a szűrletet a metanol eltávolítására csökkentett nyomáson desztillációnak vetettük alá. Az így kapott desztillálási maradék izopropanolból történő átkristályosítása 26 mg L-eritro-3-(3,4-dibenzii-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot eredményezett. [a]£0=+19,5° (c=l, etanolban). Ha ezt az L-eritro-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin-hidrokloridot az 1. (c) példában leírt módon katalitikus hidrogenolízisnek vetjük alá a hidroxilcsoportokat védő benzilcsoportok eltávolítása céljából, akkor L-eritro-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint kapunk 100%-os hozammal. 3. példa DL-Treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint, DL-treo-N-klór-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint, DL-treo-N-glikolil-3- - (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint, DL-treo-N-benzoil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint, DL-treo-N-acetil-3- (3,4-metilén-dioxi-fenil) -szerint, DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dihidroxi-fenil) - -szerint, vagy DL-eritro-N-ace.til-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint oldottunk, illetve szuszpendáltunk fel 2 mg/ml koncentrációban 7,0 pH-jú 0,1 M foszfátpufferben, hogy a kiindulási DL-szerin-vegyületekből, mint az enzimreakció szubsztrátjaiból különféle törzsoldatokat készítsünk. A szubsztrát-törzsoldatok 0,5 ml-ét azonos térfogatú enzimoldattal elegyítettük, amelyet az 1. (a) példa eljárásának megfelelően állítottunk elő, s amely a Streptomyces hachijoensis mikroorganizmus aciláz enzimét tartalmazta. Az így kapott elegyet azután 37°C hőmérsékleten 17 óra időtartamra inkubáltuk az N-acilcsoport eltávolítását jelentő dezacilezési enzimreakció lejátszódásának biztosítására. 5 A reakció lejátszódása után a reakcióelegyet nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás módszerrel megelemeztük. A HPLC-oszlop tölteteként „Nucleosil 5 C18”-t alkalmaztunk; az oszlop mérete 4,6 mm x 125 mm volt. Az analízis célja a dezacilezett reakciótermék hozamának meghatározása volt, amely a sztereoszelektív enzimatikus reakció folyamán, az N-acilcsoport hidrolitikus eltávolítása révén képződött. A kapott eredményeket az alábbi 15 1. táblázatban foglaljuk össze. 1. táblázat Szubsztrát A dezacilezett termék hozama %-ban DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin 100 DL-treo-N-klór-acetil-3- (3,4- -dibenzil-oxi-fenil) -szerin 100 DL-treo-N-glikoloil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin 31 DL-treo-N-benzoil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin 10 DL-treo-N-acetil-3- (3,4-metilén-dioxi-fenil) -szerin 68 DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin 20 DL-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin 81 A fenti táblázatban szereplő, a dezacilezett termék %-os hozamát kifejező számértékeket 40 az alábbi egyenlet segítségével számítottuk ki: A képződött dezacilezett termék mólszáma Dezacilezett termék hozama %-ban=-------------------------x 2 x 10U a szubsztrát mólszáma 4. példa Az 1. példában megadott összetételű táp közeget Actinomyces aureoverticillatus (IMC S-0234) (ISP 5080) (FERM P-7216) (FERM BP-640); Streptomyces blastmyceticus (IMC S-0189) (ISP 5029) (FERM P-7217) (FERM BP-641); vagy Streptomyces hachijoensis (IMC S-0244) (ISP 5114) (FERM P-7218) (FERM BP-642) ferde tenyészeteinek egy-egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk. Az inkubátumokat rázatás mellett 4 napig 27°C-on tartottuk. A kapott tenyészoldatból a mikróbasejteket kiszűrtük, és az így nyert tenyészoldat-szűrlet 0,5 ml-ét, amely az aciláz enzimet tartalmazta, 0,5 ml szubsztrátoldattal elegyítettük. Ez utóbbi 2 mg/ml koncentrációban 0,1 M 7,0 pH-jú foszfátpufferben oldva tartalmazta a DL-treo-N-acetil-3- - (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint. Az enzim-szubsztrát elegyet 37°C hőmérsékleten 17 órán keresztül inkubáltuk az enzimreakció 50 előidézése és lejátszatása céljából. A reakció befejeztével a reakcióeiegyet 0,1 ml 1 N sósavoldat hozzáadásával megsavanyítottuk, majd n-butanol 1 ml-es részleteivel kétszer egymás után extraháltuk. Az egye- 55 sített n-butanolos extraktumokat csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása végett. A desztillálási maradékot 0,1 M foszforsav és metanol 40:60 térfogatarányú elegyében feloldottuk, és az így kapott oldatot 60 nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás analízisnek vetettük alá ugyanazon „Nucleosil 5 CI8” oszlop segítségével, mint amelyet a 3. példában alkalmaztunk. Ily módon meghatároztuk a képződött dezacilezett termék, az L- 05 -treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin hozamát. 9
