193150. lajstromszámú szabadalom • Hibridvektor és eljárás hibridvektorok sokszorozódásának és működésének a javítására mitokondriális DNS alkalmazásával
193150 A találmány hibridvektorra, valamint hibridvektorok sokszorozódásának és működésének mitokondriális DNS alkalmazásával elért javítására vonatkozik. Már Avery et al. (J. exp. Med. 79. 137— 158 /1944/j első megfigyelései óta ismert, hogy genetikai információk egy baktériumról egy másikra átvihetők. Ez képezte az alapját az olyan technikák kidolgozásának, amelyek segítségével genetikai információk irányítottan vihetők át egy szervezetről egy másik szervezetre. Az ilyen, gyakran »genetikai manipulációdnak is nevezett módszereket például Klingmüller »Genmanipulation und Gentherapie« című tankönyve Írja le (Springer-Verlag. 1976). Minden gén-technológiai munka döntő lépése a DNS vektor segítségével történő bevezetése új gazdaszervezetbe. Vektorként eddig leggyakrabban baktériumból származó plazmidokat vagy baktériofágokból származó kettős szálú DNS-t, azaz prokarióta DNS-t használnak. Az ilyen vektorok alkalmazásának lényeges feltétele a restrikciós enzimek felfedezése volt (Arber, Linn: Ann. Rev. Biochem. 38 467—500 /1969/). Ezek endonukleáz enzimek, amelyek az említett vektorokat meghatározott helyeken szétbontják anélkül, hogy a vektor molekuláris szerkezete egyébként megváltozna. Ha más szervezetből vett DNS-t szintén endonukleáz-enzimekkel kezelnek, az első kezelt DNS sei összekeverik, majd a szétbontott vektorok és DNS-fragmensek összenövését indukáló enzimeket, ún. ligázokat adnak hozzá, új vektor keletkezik, ón. hibridvektor, amely részben más DNS- fragmenseket tartalmaz. Az ilyen hibridvektor gazdaszervezetbe jutva ott szaporodhat, sokszorozódhat (amplifikálódhat), mégpedig azért, mert a vektor prokarióta DNS-e replikációs ponttal (origin of replication) rendelkezik. Kedvező esetben a gazdaszervezetben lezajló sokszorozódás (klón-képződés) a bevitt idegen DNS-n lévő gének érvényesülésével, működésbe lépésével jár együtt. Eddig az idegen DNS sokszorozódását és érvényesülését célzó híbridvektorok gazdaszervezeteként majdnem kizárólag baktériumokat alkalmaztak, így az Escherichia coli és a Bacillus subtilis különböző törzseit. így például ismert, hogy a proinzulin képződéséhez szükséges, állati sejtekből származó információ vektor segítségével E. coli baktériumokba átvihető, és az információ ott érvényesül (Esser und Stahl: »Hybridization«, a »Handbook of Biotechnology« című kézikönyvben, Vol. I /1981 /). A módszernek azonban hátránya: vannak, amelyek a gyakorlat számára is jelentősek: a) Bebizonyosodott, hogy a prokarióta és az eukarióta DNS szerkezete az információ-tartalom szempontjából különbözik egymástól. Prokarióták esetében a genetikai érvényesülés során az összes DNS küldönc-RNS- sé íródik át (transcription), míg az eukarió-1 2 ták esetében ez nem így van. A kettős szálú DNS-ben a genetikai információ nem folyamatosan tárolódik, hanem a DNS-nek vannak információt tartalmazó szakaszai (exons) és információtól mentes szakaszai (introns). Ha ezeket az exonokat és intronokat prokariótába viszik be, előfordulhat, hogy annak fehérje-szintézise zavarttá válik. b) Az eukariótákkal ellentétben a baktériumok nem rendelkeznek a magasabbrendü szervezetek fehérje szintézisében szerepet játszó 80S-riboszómákkal, hanem csak a felsőbbrendű szervezetek mitokondriális riboszómáinak megfelelő 70S-riboszómákkal. Ez magyarázata lehetne annak a jelenségnek, hogy prokariótákba az idegen DNS gyakran beépül, de ennek ellenére a gének csak csekély mértékben lépnek működésbe. c) Azt is megfigyelték, hogy sikeres beépülés és működés ellenére az eukarióta DNS gén-termékei a prokariótákban néha másodlagos pusztulást szenvednek. d) Azt is figyelembe kell venni, hogy például Bacillus subtilus esetében az eukarióta DNS sikeres átvitele után néhány esetben a transzformáció instabilnak mutatkozott, és az átvitt genetikai információ már kevés számú nemzedék után elveszett. Ezeket a nehézségeket összefoglalóan Macleod (Nature 285, 136 /1980/) közleménye tárgyalja. Felmerült tehát az igény a fenti hátrányok leküzdésére és ezzel az eukarióta rendszerek gén-manipulálásának szélesebb alkalmazhatóságára. Ehhez pedig olyan vektorok szükségesek, amelyek eukarióta sejtekben jól sokszorozódnak és emellett ott működni is képesek. Az e cél érdekében eddig kifejlesztett rendszerekbe vetett remények nem váltak valóra. Például Saccharomyces cerevisiae (pék-élesztő) esetén olyan eukarióta plazmid, az ún. 2 p-DNS létezik, amely magához az élesztőhöz vektorként használható (Hollenberg, »Progress in Botany«, 42, 171 —185 /1980/). Ez a rendszer azonban — miután állati sejtekből származó, a ß-globint kódoló genetikai anyagot vittek bele — az információ átíródása során nem tudott pontos különbséget tenni intronok és exonok között, azaz az állati DNS megkettőzése pontatlan volt (Beggs et al. »Nature«. 283, 835—840 /1980/). Emellett az ilyen jellegű hibridvektorok még élesztősejtekben sem sokszorozódnak valami jól. Történtek kísérletek az állati eredetű sejtek gazdaszervezetkénti felhasználására is, ahol vektorként vírusokat alkalmaztak. A módszer azonban igen ráfordításos, és ezért a gyakorlatban nem terjedt el. Azt találtuk, hogy az említett nehézségek olyan hibridvektorral győzhetők le, amely valamilyen mitokondriális DNS egy replikációs ponttal rendelkező szegmenséből és adott 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
