193150. lajstromszámú szabadalom • Hibridvektor és eljárás hibridvektorok sokszorozódásának és működésének a javítására mitokondriális DNS alkalmazásával
193150 esetben baktériális plazmidből képzett szegmensből épül fel. A mitokondriális DNS — kettős szálú eukarióta DNS lévén — igen alkalmas a vek" tor szerepére, tekintettel arra, hogy nem kötődik a kromoszómákhoz, és az összes sejtben viszonylag nagy számú másolatként van jelen. Emellett gyűrűs DNS, tehát a többi DNS-től könnyen választható el, és főleg: replikációs ponttal rendelkezik, azaz képes önmagát reprodukálni. A szerkezetét nézve a mitokondriális DNS a kromoszóma DNS és a prokarióta DNS között áll, ugyanis intronokat tartalmazó génjei is, intronok nélküli génjei is vannak (Michaelis et al., »Progress in Botany« 42. 227— 233 /1980/). Ezért a mitokondriális DNS alkalmas arra, hogy vektorként mind eukarióta, mind prokarióta rendszerekben használjuk. A mindenkori szervezettől függően a mitokondriális DNS 5—30 pm hosszú. Ezért már technikai okokból is az egész gyűrűs molekula vektorkénti alkalmazása gyakran lehetetlen. A mitokondriális DNS-bő! tehát olyan szegmenseket kell kivágni, amelyek replikációs pontot tartalmaznak. Amennyiben az adott mitokondriális DNS-t restrikciós enzimek segítségével már feltérképezték, azaz a replikációs pontok helye ismert, az alkalmas körülmények között amplifikálódásra képes DNS-szegmensek endonukleáz enzimek segítségével minden további nélkül kivághatok. Még fel nem térképezett mitokondriális DNS esetén először alkalmas és replikációs ponttal rendelkező szegmenst kell keresni a DNS- ben. Különösen előnyös módon a találmány szerinti hibridvektor előállításához mitokondriális DNS-ként a Podospora hifás gombában előforduló és már régóta részletesen leírt pl-DNS-t használjuk fel. A pl-DNS közelebbről nézve gyűrű alakú, kovalens kötéssel zárt DNS, amely az említett gomba öregedő micéliumaiban rendszerint előfordul és meglepő módon sok mindenben hasonlít a gén-technológiai munkához általánosan használt baktériumeredetű plazmidokhoz. így molekulasúlya 2,4 kb. kontóra hossza 0,75 pm. úszási sűrűsége 1,699 g/cm3. A Podospora gomba fiatal micéliumában a pl-DNS a mitokondriális DNS-nek szerves része; ha ebből felszabadul, a Podospora sejtek elhalnak. A szabad pl-DNS-nek saját replikációs pontja van, tehát reprodukálni tudja önmagát, így arra is képes, hogy hifák vagy protoplasztok fúziója révén más sejtbe jutva ott öregedési folyamatokat váltson ki. A fentiekben leírt pl-DNS-molekulából és valamilyen baktériális plazmidből, például a pBr 322 plazmidből önmagában ismert módon hibridvektort építhetünk fel. Ezt a hibridvektort az Escherichia coli ban, de a Podospora gombában is klónozhatjuk, ugyanis mind a baktériumban, mind a gombában 3 megfigyelhető a hibridvektor két szegmensének megfelelő géntermékek működése. A hibridvektor bevezetése után az Escherichia coli-ban és a Podospora gombában egyaránt kimutatható az ampicillin elleni rezisztenciáért felelős gén működése (az ampicillin elleni rezisztenciát okozó gén a baktériális szegmensen van és a sejtben ß-laktamäz képződését indukálja, ami rezisztenciát eredményez). A gombában továbbá bizonyos öregedési folyamatokat figyelhetünk meg, amelyek a hibridvektor pi-DNS-szegmensére vezethe tők vissza. Kézenfekvő, hogy az öregedési jelenségek érvényesülése a Podospora fajtákkal végzett gén-technológiai munkálatokat erősen gátolná. Ezért a hibridvektorok felépítéséhez előnyösen olyan Podospora törzset használunk, amelynél az öregedési tünetek már nem mutatkoznak. Ilyen Podospora mutánsok ismertek. A találmány tárgya tehát eljárás eukaríó ta és prokarióta szervezetben egyaránt alkalmazható, mitokondriális DNS replikációs ponttal rendelkező hibridvektorok előállítására. A találmány értelmében Ascomycetes g^mba osztályba tartozó fajták mitokondriális DNS-ét fragmentáljuk, a mitokondriális replikációs pontot tartalmazó íragmenseket e különítjük, majd prokarióta plazmid fragmensével Egáljuk, és az így kapott hibridvaktorokat gazdaszervezetbe építve biokémiai reakciók alapján azonosítjuk. A fentiek szerint felépített vektorral prokarióta és eukarióta DNS egyaránt vihető be alkalmas gazdasejtbe. A találmány utat mutat a gyakorlati gén-technológiai módszerek alkalmazásakor eddig felmerült nehézségek leküzdésére. /. pl-DNS elkülönítése Podospora anserina gombából A pl-DNS kinyerésének kiindulási törzse a Podospora anserina S: jelű vad törzse (Esser, »Handbook of Genetics«, Vol. I, 531—551 / 974/). E gomba öregedés előtti micéliumát a fenti publikációban leírt teljes táptalajon, Fernbach féle lombikban 26°C-on mintegy három héten keresztül inkubáljuk. Utána a pl-DNS-t elkülönítjük és tisztítjuk a Stahl és munkatársai (Molec. gen. Genet. 178, 639— 646 /1980/) által kidolgozott módszer szer nt. Az így kapott pl-DNS (úszási sűrűség CsCl-ben 1,699 g/cm3) a molekulasúly tekintetében igen heterogén, ugyanis oligomer, gyűrű alakú molekulák egész sorából áll, de a 0,75 pm kontúra-hosszúságú alapegység mindegyiknél ugyanaz. Megfigyelték, hogy akár 13 ilyen alapegység egyetlenegy molekulát alkothat. Alapegységenként csak egyetlenegy vágó helyei tartalmazó restrikciós endonukleáz-enzimekkel, így 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
