193078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi leukocita interferon előállítására
A találmány ipari biológia területre vonatkozik, és tárgya emberi vér leukocitájából interferon előállítási eljárása. Ismert egy olyan eljárás az emberi leukocita interferon előállítására, amelyben a vér eritrocitájától a leukocitákat elkülönítik, majd a leukocitát tartalmazó plazmát elválasztják, a plazmasejtfrakciót centrifugálják, a visszamaradó eritrocitát ammónium-kloriddal hemolizálják, a leukocita csapadékot, tápközegben reszuszpendálják, majd ezután következik az interferon bioszintézise és a végtermék izolálása [V. D. Solovev, G. A. Baktemirov „Interferon v. teorii i praktike mediciny" (Interferon in der medizinischen Theorie und Praxis, M., 1970)]. Az említett eljárással nagyon kicsi kitermelés érhető el, egy liter feldolgozandó vérből legfeljebb 1X106 IE mennyiségű végterméket állíthatnak elő, amely nyilvánvalóan a leukocita életképességének csökkenésére vezethető vissza. Ezt a csökkenést a leukocita elválasztására alkalmazott eljárás okozza. Ezenkívül a leukocita eltávolítás után keletkezett plazma, dextrán tartalma miatt, nem alkalmas további feldolgozásra. Ismert egy másik előállítási eljárás az emberi leukocita interferonra, amely alapján a vért először centrifugálják, majd a leukocitát elválasztják, az interferont bioszintetizálják és a végterméket izolálják [Kauppinen H. -U., Myllylä G. „Human Interferon" 6,1978, S. 1 — 13], Ezzel az eljárással a végterméket az előzőhöz képest magasabb kitermeléssel állítják elő. A kitermelés a feldolgozandó vér 1 térfogategységére vonatkoztatva 4X106 IE. A leukocita elválasztása után keletkezett plazmát alkalmazhatjuk további feldolgozáshoz vagy betegek transzfúziójához vérpótló szerként is. Mindezek ellenére nem túlságosan magas a kitermelés, ugyanis a vér centrifugálásakor keletkezett buffy coat levételével elkülönített, interferont termelő sejtek mennyisége a vérben lévő leukocitáknak legfeljebb csak 15 százaléka. Találmányunk célja az emberi leukocita interferon előállítására olyan eljárás kidolgozása, amellyel a leukocita elválasztását úgy folytatjuk le, hogy a végtermék kitermelését megnöveljük. Ezt a feladatot úgy oldjuk meg, hogy az emberi leukocita interferon előállítási eljárásban először a vért centrifugáljuk, a leukocitát elválasztjuk, elvégezzük az interferon bioszintézisét, és izoláljuk a végterméket. A találmány szerinti eljárásban a vér centriíugálását 1500-5000 g gyorsítással végezzük, és a leukocita elválasztásához a leukocitát tartalmazó eritrocitás massza 15-75 százalékát kitevő részt leszedjük. A centrifugálás után keletkezett leukocitát tartalmazó eritrocitás masszában a leukocita térfogat szerint oszlik el. A leukocita mennyisége a buffy coat eltávolítása után 2 1 egy-egy térfogategységgel csökken. Ezáltal a leukocita elválasztására szolgáló találmány szerinti eljárással jelentősen megnövelhetjük a vérből elválasztott leukocita mennyiségét, amely lehetővé teszi, hogy fokozzuk a bioszintézissel előállított interferon kitermelését. A leukocitát tartalmazó eritrocitás masszáról leszedett felső rész térfogata függ a centrifuga gyorsításával létrehozott leukocitakoncentráció térfogati megoszlásától. 1500 g gyorsulásnál és a leukocitát tartalmazó eritrocitás massza 75%-át kitevő felső rész levételekor jelentősen megnő a hemolízisnek kitett eritrocita mennyisége, amely végsősoron a vértermék kitermelésének csökkenését eredményezi. Ha a leukocitát tartalmazó eritrocitás massza 15 téríogat%-ánál kevesebb felső részt veszünk le, és a gyorsulás 5000 g, akkor a leukocita kitermelés erősen csökken, amely a végtermék kitermelésének csökkenését okozza. Ha a vér centriíugálása 1500 g alatt történik, akkor jelentősen növelnünk kell a centrifugálási időt, hogy ezáltal az eritrocitás maszsza felső részében a leukocita koncentráció nagy legyen, ami végsősoron a végtermék kitermelésének csökkenését okozza. Ha a vér centrifugálása 5000 g felett történik, akkor a leukocita szétzúzódik, amely a végtermék kitermelésének csökkenését okozza. Az emberi leukocita interferon találmány szerinti előállítási eljárása a következő: A véradók vérét stabilizátort tartalmazó tartályokba gyűjtjük. A gyűjtés után a vért rögtön centrifugáljuk, hogy a plazmát az eritrocitás masszából elválasszuk. A plazma eltávolítása után az eritrocitás massza 15— 75%-ot kitevő felső részét összegyűjtjük és a leukocita csapadékot elkülönítjük. Az igy kapott leukocita csapadékot emberi vérszérumot tartalmazó tápközegben reszuszpendáljuk. Ezután a tápközegben reszuszpendált leukocitát emberi leukocita interferon kis adagjával kezeljük. Az így előállított leukocita szuszpenzióhoz indikátorként a Newcastlebetegségeket előidéző vírust vagy a Sendaivírust adjuk és a szuszpenziót inkubáljuk. Az inkubálási idő eltelte után a szuszpenzióhoz egy friss, az emberi vérszérumot tartalmazó tápközeget adunk, majd az inkubálást folytatjuk. Az interferon bioszintéziséhez olyan tetszés szerinti összetételű szintetikus tápközeget alkalmazunk (Eagle MEM, RPMI 1640, McCoy-tápközeg), amelynek fontos komponense az emberi vérszérum. Az inkubálási idő eltelte után a tenyésztő folyadékot centrifugálással a termelő sejtektől elkülönítjük. A sejtcsapadékot elválasztjuk, és a tenyésztő folyadékot savas közegben állni hagyjuk, így az indukáló vírust inaktiváljuk, majd megadjuk az interferon titerét. A továbbiakban a találmány megvalósítására konkrét példákat sorolunk fel. 2 193078 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
