193053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására
1 193053 2 3. példa Limfotoxin termelés szérummentes tápoldatban ' Szérum tartalmú tápoldatban történő szaporítás után (lásd a 2. példát) a sejteket szérum-mentes tápoldatban visszük át. A következő táblázatban az 1670 sejtek limfotoxin termelésének (lásd az 1. példát) összehasonlító adatait mutatjuk be szérum 5 tartalmú és szérum-mentes tápoldatban, 20 ng/ml Mezerein jelenlétében: Kísérlet A tápoldat szérum tartalma (%) Limfotoxin aktivitás (RE/ml) Protein tartalom (mg/ml) Specifikus aktivitás (RE/mg) 1 10 370 5 74 2 10 180 5 36 3 10 270 5 54 4 0 '40 0,050 2.800 5 0 72 0,053 1.400 6 0 160 0,044 3.700 A protein meghatározásokat Bradford módszerével lAnal.Biochem., 72, 298 (1976)] végeztük. 4. példa 1670-seitek által termelt limfotoxin koncentrálása és tisztítása PCG-oszlopkromatográfiával ’ 1670 sejteket tenyésztünk 10% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI1640 tápoldatban, rázott Erlenmeyer lombikokban (1 literes lombikban 0,5 liter tenyészet; fordulatszám; 40/perc). A jól növekedő tenyészetekből a sejteket lecentrifugáljuk, mossuk és szérum-mentes, 20 ng/ml Mezerein tartalmú RPMI1640 tápoldatban reszuszpendáljuk. A szuszpenziót 150 cirP-es műanyag tenyésztő edényben (edényenként 200 ml) 3 napig állni hagyjuk, végül centrifugál-ással és szűrés- 30 sei állítjuk elő a tenyészet felülúszóját. Az ily módon kapott felülúszót 10 ml PCG-n kromatografáljuk (pórúsátmérő: 350Â; szemcsenagyság: 120-200 mesh; oszlop 35 átmérő: 9 mm; átfolyási sebesség: 140 ml/óra). Az oszlopot ezután 10 milimólos nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,2), amely nátrium-kloridra 1,5 mólos, mossuk, végül ugyanezen pufferrel— 50% etilénglikol (téri./téri.) tartató lommal — eluáljuk. Két ilyen kísérlet eredményét tartalmazza a következő táblázat: Térfogat Limfotoxin Protein Specifikus (ml) (RE/ml) % (mg/ml) aktivitás (RE/mg) 1. kísérlet Minta 2.800 162 100 0,044 3.700 Átfolyás 2.800 13 8-Mosófrakció 10 96 1-Eluátum 20 17.300 76 2,0 8.650 2. kísérlet Minta 2.500 141 100 0,050 2.800 Eluátum 17 8.600 41 1,6 5.400 6
