193053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására

193053

5. példa

Limfotoxin-mRNS-aktivítás kimutatása 1670 és 1022 sejtek RNS-preparátumaibóT

A sejteket 800 ml 10% íetális borjúszéru- 5 mot tartalmazó tápoldatban szuszpendáljuk úgy, hogy a sejtek sűrűsége körülbelül 5X105 sejt/ml legyen, majd hozzáadunk üdénként 20 ng mezerein-t. Húsz órával később a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, 10

megfelelő pufferben (például 10 raM trisz-sósav (pH = 7,4), 140 mM nátrium-klorid és 1,5 mM magnézium-klorid tartalmú puffer] mossuk és 10 ml Lyse-pufferben [például 10 mM trisz-sósav (pH = 8,4), 140 mM nát- 15

rium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid és 0,5% Nonidet-P 40 (nem ionos detergens, a Shell cég márkanevével) tartalmú puffer] szuszpendáljuk. A szuszpenziót 10 percig inkubáljuk jégfürdőben, majd rövid ideig rázzuk 20 és a sejtmagokat centrifugálással távolítjuk el.

1

A centrifugálás után kapott felülúszóból ( = citoplazma) ismert eljárással — például fenolos extrahálással [Aviv és munkatársai, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 69, 1408-1412 (1977)]— izoláljuk az RNS-t. Az izolált RNS-t vízben oldjuk (koncentrációja körülbelül 3-5 mg/ml) és ismert eljárással Xenopus laevis oocitákban transzlatáljuk [például: Colman és munkatársai, Cell, 1_7, 517-526 (1979) ; Hitchcock és munkatársai, Anal.Biochem., 109, 338-344 (1980); Contreras és munkatársai, Anal.Biochem., 113, 185-187 (1981)]. A transzlációs termékek limfotoxin aktivitását biológiai módszerrel vizsgáljuk.

A következő táblázatban az oocita felülúszókban mért citotoxikus aktivitást mutatjuk be, összehasonlítva a MOLT-4 sejtek — humán-T-limfocita-sejtvonal, melynek tenyészlevében nincs kimutatható limfotoxin aktivitás — RNS preparátumaival és a kezelet-; len oocita felülúszókkal:

2

Preparátum A felülúszó radioaktivitása

(cpm/100 pl)

Az oocita felülúszók higitása

1 : 12

1 : 42

1 : 147

1 : 514

Kontrollok

oociták)

(nem oltott

2.200

2.300

2.100

2.500

2.400

2.200

1.800

3.000

MOLT-4 RNS

1. kísérlet

1.600

2.400

1.700

2.200

2. kísérlet

1.700

2.300

1.600

1.800

1670-RNS

1. kísérlet

4.700

4.700

3.600

2.800

2. kísérlet

4.300

3.800

3.300

2.600

3. kísérlet

3.200

2.800

2.800

Kontrollok

4.400

3.300--1670-RNS

1. kísérlet

6.100

5.000--2. kísérlet

6.600

5.100

—

_

A táblázatból látható, hogy mindhárom ßO 1670 sejt-RNS preparátum szignifikánsan növeli a felszabaduló radioaktivitást, egészen a 147-szeres hígításig, míg a MOLT-4 sejtek ilyen aktivitást nem mutatnak. Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az 1670 sejtek biológiailag aktív limfotoxin-mRNS-t tartalmaznak.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás limfotoxin vagy limfotoxin-mRNS előállítására azzal jellemezve, hogy herpes vírussal transzformált majom-T-limfocita 1670 sejtvonalat megfelelő tápoldatban folyamatos tenyészetben szaporítunk és a limfoto-7