193053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására
1 193053 2 alkalmazzuk [Trivers és munkatársai által módosított eljárás, J. Immunoi., 117, 130—135 (1976) és Evans, Cell. ImmunöT!7 63, 1 — 15 (1981)]: L929 sejtvonalú transzformált egérsejteket tenyésztünk egy éjszakán át 1 microcurie aktivitású 3H-timidin/ml tartalmú tápoldatban (előnyös a 10% fetális borjúszérumot tartalmazó Eagle MEM tápoldat), a tenyészetet ezután tripszinnel kezeljük és friss, 5% fetális borjúszérum tartalmú tápoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióból 0,5 ml-eket, azaz kb. 30.000 sejtet, tenyésztő edényekbe (átmérő: 16 mm) pipettázunk és 3-6 órán át inkubáljuk. A vizsgálandó mintákból végül sorhígitást készítünk, s ezeket 3 napig inkubáljuk (minden inkubálás 37° C-on történik). A tenyészetek felülúszójának radioaktivitását folya dék-szcinti 11 ációs számlálóval mérjük. A következő táblázatban az 1670 sejtek egyik tenyészetének felülúszójában mért limfotoxin aktivitások eredményeit mutatjuk be. Minden hígításból 4 parallel tenyésztőedényt vizsgálunk. Csak a középértékeket adjuk meg, a standarddeviáció az első három hígításnál 3—4%, a legnagyobb hígításnál 6%. Az ebben a vizsgálatban használt tenyész-Kezelés levet sok száz ampullában lefagyasztjuk és minden limfotoxin vizsgálatnál referenciastandardként használjuk; aktivitását önkényesen 100 referencia-egység/ml-ben (RE/ml) állapítottuk meg. Az eredményeket az 1. ábra mutatja be. A fent leírt biológiai limfotoxin teszt segítségével egy sor emberi T-limfocita sejtvonalat (MOLT-4, 1301, JURKAT, Karpas-45, CCRF-CEM és CCRF-HSB-2) vizsgáltunk meg összehasonlításúl. A kezeletlen kontrollokhoz képest egyetlen esetben sem tudtuk kimutatni a 3H-timidin felszabadulásának szignifikáns emelkedését, b) Az 1670 sejtvonal tenyészet felülúszójában lévő limfotoxin aktivitásnak fizikai-kémiai jellemzésére a következő kísérleteket végeztük} hőterheléssel szembeni stabilitás, savanyú pH értékkel szembeni stabilitás, fagyasztás/olvasztás hatása a stabilitásra, nátrium-dodecil-szulíáttal (SDS) szembeni stabilitás, redukáló anyagokkal (2-merkapto-etanol) szembeni stabilitás, molekulasúly meghatározás magasnyomású folyadék-kromatografiával (HPLC). A stabilitási vizsgálatok eredményét az alábbi táblázatban mutatjuk be: 5 10 15 20 25 Limfotoxin aktivitás a kontrollérték százalékban 56° C - 5 órán át 68% Fagyasztás/olvasztás ötször 108% pH = 2,0 - 24 órán át 4°C-on 1% 0,1% SOS - 1 órán át 37°C-on 15% 0,1 mól 2-merkapto-etanol - 1 órán át 37°C-on 95% Aktivításá stabil marad merkaptoetanolos kezeléssel és hevítéssel szemben, valamint többszöri fagyasztás/olvasztás ciklus hatásával szemben, pH = 2 hatására 24 órán belül aktivitását teljesen elveszti. 45 A hővel, pH-val, valamint a fagyasztás/olvasztással szembeni stabilitásra vonatkozó kísérleteket kezeletlen 1670 sejtek standard tenyészetével — 10% fetális borjúszérum 50 jelenlétében — végeztük. A másik két kísérletet mezerein-el (20 ng/ml; lásd a 4. példát) kezelt 1670 sejtek tenyészetének felül úszójává 1 (protein-tartalom: 1-2 mg/ml) végeztük, melyet kontrollált pórusú üvegdarával kon- 55 centráltunk és dúsítottunk. A tenyészetet SDS- el, illetve merkapto-etanollal való inkubálás után 50-szeresére hígítottuk komplett tápoldattal (10% borjúszérum). Az 1670 sejtekből származó limfotoxin molekulasúlyát HPLC-vel határoztuk meg (lásd a 2. ábrát). 1670 sejtek tenyészetének felülúszójából — melyet PCG-vel koncentráltunk — 200 pl-t HPLC-vel [WATERS berendezés; két 1-125 oszlop; 20 mM nátrium-foszfát 65 (pH = 7), 1 M nátrium-klorid, 0,1% Tween 20 (polioxietilén-szorbitán-monolaureát, n = 20,mólsúly: körülbelül 1200), 25% propilénglikol; 0,5 ml percenként]választunk el. 0,5 ml-es frakciókat szedünk és ezeket vizsgáljuk. A molekulasúly meghatározásánál az öszszehasonlításul szolgáló proteineket, a szérum-albumint, ovalbumint, tripszinogént és lizozimet ugyanabban a rendszerben választottuk el.A vizsgálat egyetlen aktivitás-csúcsot mutatott a 60.000^15% molekulasúlynál, c) Az 1670 sejtvonal tenyészet felülúszóinak növekedés gátló hatását egy sor transzformált (tumor-) sejtvonalon vizsgáltuk meg. Ezekben a vizsgálatokban a tumorsejteket Eagle MEM tápoldatot (kiegészítve 10% fetális borjúszérummal, penicillinnel és streptomicinnel) tartalmazó, 3 cm átmérőjű tenyésztő edényekbe visszük be (50.000 sejt edényenként) és néhány órával később táptalajt, vagy az 1670 sejtvonal standard tenyészetének felülúszóját adjuk hozzájuk (vég-koncentráció: 16 RE/ml; 3 ml/edény). Az edényeket 3N—4 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a sejtszámot minden edényben meghatározzuk (min-4
