192962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy gonadotróp aktivítású leteinizáló és ösztron-stimulálo hormonokat felszabaditó faktor analógok előállítására
4 192962 5 1%-os volt. A teszt eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat Az LP + PHS szint 200 /ug-os I.RP illetve analógjaival való kezelés után vegyület FS hatás a határa /ideje perc átlagos 0 FSH koncentráció /ug/ml hatóanyag nincs — — 31.2 ± 1.9 LRF 40 ± 11.5 100 ± 26.7 108.4 ± 16.1 VI 26.7 ± 3.8 43 ± 20.4 72.4 ± 10.9 VII 40.0 ± 6.0 230 ± 32.1 110.9 ± 11.7 vegyület lut. hatás a hatás ideje átlagos j3" LH koncentráció hatóanyag perc perc /ug/ml nincs — 0.26 ± 0.04 LRF 53.3 ± 13.9 12.3 ± 5.0 7.43 ± 1.6 VI 46.6 ± 15.4 86.7 ± 10.7 3.88 ± 1.3 VII 53.3 ± 19.0 236.7 i 10 11.24 ± 1.59 A (VII) képletü vegyületet két dózisszinten vizsgáltunk, és azt találtuk, hogy jelentős agonisztikus hatása van; ez a vegyület aktívabb volt, mint a (VI) képletű vegyület, vagyis a megfelelő tozil-származék, jq és sokkal aktívabb, mint a természetes LRF, amely az összehasonlítás alapjául szolgált. A találmány szerinti D-Tle-vel való helyettesítése az LRF hatásának és hatási idejének jelentős megnövekedését eredményezte, ez vi- 35 lágosan megfigyelhető volt még 10 p g per állat dózis esetében is. A részlegesen védett (VI) képletű prekurzorról bebizonyosodott, hogy jelentőse aktivitással rendelkezik. Ez megerősíti az említett 6-os helyzetben való 40 szerkezeti eltérésnek a peptid molekula konformációjára (térbeli elrendeződésére) gyakorolt hatását. A helyettesítés kedvező hatásának mértéke jelentősen túlhaladja a 8-as helyzetben lévő Arg tozilezésének ellenkező 15 előjelű hatását. A természetes LRF megfelelő 8-tozil-származéka ténylegesen majdnem inaktív volt. Az (I) általános képletű nonapeptidek a megfelelő aminosav vagy alacsonyabb szén- 50 atomszámú peptid-csoport reakciójával a peptidkémiából ismert preparatív módszerekkel állíthatók elő. Az (I) általános képletű vegyületek előnyösen a (II) általános képletű hexapeptid- 55 -származék Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (II) I X mely képletben X jelentése az (I) képletben megadottal 60 megegyezik, Y pedig hidrogénatomot vagy egy hidrogénezésael eltávolítható védőcsoportot, előnyösen benziloxi-karbonil-csoportot jelent, 65 és a (III) általános képletü tripeptid reakciójával pGlu-GÍ8-Trp (III) és kívánt esetben a védőcsoportok lehasításával állíthatók elő. Az addiciós reakciók oldatban, mely a peptidkémia klasszikus preparatív technikája (Schroeder, E., Lübke, K.: The Peptides. Vol. I és II, Acad. Press, New York, 1965) vagy szilárd fázisban (Stewart, J.M., Young, J.D.: Solid phase peptides synthesys. W.H. Freeman Comp., San Francisco, 1969.) is végrehajthatók. Eljárásunk szerint a terminális amino-csoportokat előnyösen egy benziloxi-karbonil-CBoport bevitelével védtük meg, az oldalláncok funkciós csoportjait - az egyetlen Arg kivitelével - nem volt szükséges megvédeni. Az arginin guanidino-csoportjénak megvédését tozil-csoporttal végeztük. Ez szokványos módszerekkel eltávolítható, mi egy új eljárást dolgoztunk ki rá; trifluor-metán-szulfonsav és trifluor-ecetsav oldatának és egy megfelelő védő ágens pl. tioglikolsav keveréke bizonyult megfelelőnek a tozil-csoport eltávolítására. Ez az eljárás biztosítja a tozil-csoport gyors eltávolítását anélkül, hogy a maradék érzékeny peptid-rész deteriorálódna és ennek következtében sokkal magasabb kitermelést eredményez, mint az ismert eljárások. A védőcBoport lehasítása után a kapott terméket rögtön tisztíthatjuk folyadékkromatográfiás módszerrel, ez a találmányunk szerinti nonapeptid nagy tisztaságban való kinyerését eredményezi. Stocionárius fázisként előnyösen a felületén kémiailag kötött 8-10 szénatomszámú Bzénhidrogénréteget tartalmazó 10-30 /um szemcsenagyságú szilikagélt használtunk. Az eluciót az alkalmazott peptid vegyületre számított 20-60 tf% mennyiségű metanol és 0,1-0,5%, előnyösen 0,2% vizes trifluor-ecetsav keverékével mint mozgó fázissal végeztük. A trifluor-ecetsav mint ionizá4
