192962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy gonadotróp aktivítású leteinizáló és ösztron-stimulálo hormonokat felszabaditó faktor analógok előállítására
6 192962 7 ció-visszaszorító jelenlétére azért volt szükség, hogy megfelelő elválasztást kapjunk. Ez az eljárás lehetővé tette a vegyületek egy lépcsőben való tisztítását, anélkül, hogy sómentesítésre íb szükség lett volna. A folyadékkromatográfiát eddig hasonló peptid-vegyületek tisztítására nem használták. Az előbb említett mozgó fázist úgy hoztunk létre, hogy az eddig leírt mozgó fázisokban jelenlévő különböző pH-jú puffer-oldatokat, melyek az ionizáció szabályozására szolgáltak, megfelelő oldószerrel helyettesítettük. Amikor puffer-oldatot is tartalmazó elegy a mozgó fázis, az elválasztott termékeket még egy további lépésben sómentesíteni kell, amely az elválasztást igen munka- és időigényessé teszi. A találmányunk szerinti eljárást a kővetkező példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. A példákban a jelölések jelentése a következő: Z benziloxi-karbonil-csoport, Tos tozil-csoport, DCHA diciklohexil-amin. 1. példa Z-Pro-NH-Et előállításai!) 50 g (0,2 mól) Z-Pro-t oldunk 170 ml dimetil-formamid és 21 ml piridin elegyében, és az oldatot -40 °C-ra hűtjük. 29 ml (0,22 mól) pivalil-kloridot adunk a keverékhez és 10 percig keverjük 30 °C-on. A reakcióelegy -40 °C-ra való lehűtése után 10 g (0,21 mól) etil-amin és 50 ml dimetil-formamid keverékét adjuk hozzá. Egy éjszakai állás utón 0 °C-on a dimetil-formamidot desztilláljuk és a maradékot etil-acetátban oldjuk és hagyjuk kikristályosodni. 50 g terméket kapunk. O.p.: 125-130 °C. Kitermelés: 91%. 2. példa Z-Arg(Tos)-Pro~NH-Et (II) előállítása 4,5 g (16,2 millimól) Z-Pro-NH-Et-ról eltávolítjuk a védőcsoportot ecetsavas hidrogén-bromid oldattal való kezeléssel. 20 perces szobahőmérsékleten való állás után a hidrobromidot éterrel kicsapjuk és rögtön 30 ml dimetil-formamidban oldjuk. 10 g (17,8 millilmól) Z-Arg(Tos)DCHA-t 2 n sósavval elbontunk, és a felszabadult Z-Arg(Tos)DCHA-t etil-acetáttal extraháljuk. Az oldószer desztillálása után ezt a terméket hab formájában kapjuk. Az anyagot 60 ml dimetil-formamidban oldjuk, -40 °C-ra hűtjük le, és ezen a hőmérsékleten 1,4 ml (20 millimól) piridint, 2,2 ml N-etil-piperidint és 2,1 ml (18 millimól) pivalil-kloridot adunk hozzá. 20 perces -30 °C-on való keverés után a Pro-NH-Et HBr fenti oldatát adjuk hozzá, és az elegy pH-ját 7,5-re állítjuk be N-etil-piperidinnel, majd egy éjszakán keresztül a hűtőszekrényben (-5 °C) állni hagyjuk. Az illékony komponenseket lehajtjuk, a maradékot etil-acetáttal extraháljuk és az; extraktumot egymás után 1 n sósavval, 5% nátrium-hidrogénkarbonót-oldattal és vízzel mossuk. Ezután az oldószert ledesztilláljuk egyidejű vízmentesítés mellett. 6,02 g (63%) anyagot kapunk hab formájában. Aminosav-összetétel analízis: Pro = 0,91; Arg = 1,09. 3. példa ■ Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH~Et (III) előállítása 6 g (8,7 millimól) Z-Arg(Tos)-Pro-NH-Et-ről lehasítjuk a védőcsoportot ecetsavas hidrogén-bromid-oldat segítségével. A hidrogénbromidot éterrel kicsapjuk az oldatból és azonnal 25 ml dimetil-formamidban átoldjuk. Az ezt követő kondenzációt ismét a fenti vegyes anhidrides módszerrel hajtjuk végre 3,72 (8,7 millimól) Z-LeuDCHA-t, 1,2 ml (10 millimól) pivalil-kloridot, 0,83 ml (8,7 millimól) piridint és 1,19 ml (8,7 millimól) N-etil-piperidint használva. Dimetil-formamidot alkalmazunk oldószerként. A terméket a 2. példában leírt módon izoláljuk. A kapott termék 4,5 g (73%) súlyú, hab formájában nyerjük. Aminosav összetétel analízis: Leu = 0,98; Arg = 1,09; Pro = 0,93. 4. példa Z-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (IV) előállítása 2,6 g (5,82 millimól) Z-D-Tle DCHA-t 0,1 n kénsavval kezelünk, hogy elbontsuk a sót, és a felszabadult Z-D-Tle-t etil-acetótba extraháljuk át. Az oldószer ledesztillálása után 2 g olajos terméket kapunk, amelyet 20 ml metilén-kloridban oldunk. 4 g (5,7 millimól) (III) képletű vegyületet dekarbo-benzoxilezünk ecetsavas hidrogén-bromid-oldat segítségével. A termék metanolos oldatát OH" fázisban lévő ioncserélő gyanta oszlopon vezetjük keresztül a hidrobromid-só felszabadítása céljából. 2,9 g Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et-t kapunk hab formájában. Ez a termék pH = 2,5-nél és 5,7-pél elektroforetikusan homogén (a kimutatás ninhidrinnel történt). A kapott szabad tripeptid araidot 15 ml metilén-kloridban oldjuk és -20 °C-ra hűtve az előzőleg elkészített Z-D-Tle oldatot és 2 g-(9,7 millimól) diciklohexil-karbodiimid és 10 ml metilén-klorid elegyét adjuk hozzá. A reakciókeveréket 4 napon keresztül -5 °C-on állni hagyjuk. Ezután a diciklohexil-karbamid csapadékot szűrjük, a szűrletet desztilláljuk, és a maradékot etil-acetátban oldjuk. A fenti terméket egymást követően 1 n sósavval, 5%-os nátrium-hidr«-5 ; 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
