192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
6 19289 2,2±1,5 mraól (2, 5-diketo-D-glükonsav szubsztrátum 0,1 mólos trisz-pufferban (pH = 7) 30 °C-on). A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz igény be vehető olyan alkalmazási területeken, ahol az ismertetett enzimhatás megmutatkozik. Így 2-keto-L-gulonsav és L-szorbóz állítható elő 2, 5-diketo-D-glükonsavból, illletve 5-keto-D-fruktózból, redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát koenzim jelenlétében. 2-keto-L-gulonsav előállítása esetében például a reakció általában 25-45 #C hőmérsékleten és 67 pH-értéken megy végbe. A reakcióban résztvevő szubsztrátum, a 2, 5-diketo-D-glükonBav moláris koncentrációja azonos hidrogén-donor, a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátéval, és az enzimreakciókkal kapcsolatos általános ismeretek alapján meghatározható. A reakcióhoz megfelel a 20-200 ) mmól moláris koncentrációtartomány. Az enzimet a szubsztrátummal előnyösen 0,5-5,0 egység/ml koncentrációhatárok között reagáltaljuk. Az enzimet a reakcióban egy megfelelő hordozóhoz rögzített állapotban is használhatjuk. Az enzim rögzítésére általában alkalmazható a szakirodalomból ismert bármely módszer. így például az enzim közvetlenül kapcsolható egy membránhoz, funkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező gyanta granulátumaihoz vagy hasonlókhoz vagy kapcsolható a gyantához bifunkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező vegyületeken, például glutáraldehiden keresztül. Az enzimreakció időtartamára különösebb korlátozást nem adunk meg, de 30 °C-on 60- 120 perc alatt végzett reakcióban a 2, 5-diketo-D-glükonsav szubsztrátumnak 90%-a vagy ennél nagyobb része redukálható 2- - ke to- L-gulonsavvá. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük. A példákban alkalmazott rövidítések: 25DKG = 2, 5-diketo-D-glükonsav; 5KF = 5-keto-D-fruktóz; NADPH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát; 2KLG = 2-keto-L-gulonsav; NADH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleolid J. példa 1) Sejttenyésztés I) tápközeg az előtenyésztéshez 60 ml alábbi összetételű tápközeget 500 ml-es lombikba tesszük és 120 #C-on 15 percig sterilizáljuk: D-glükóz 1.0% É lesztőkivonat (Difco) 0.5% Bacto-pepton (Difco) 0.5% NaNOa 0.1% KHjPO« 0.1% MgSO«.7HaO 0.02% pH = 7 II) Tápközeg a tenyésztéshez 20 liter alábbi összetételű tápközeget 50 ppm (rész a millióban) habzásgátlóval (polipropilénglikol P-2000) 30 literes fermentoredénybe teszünk és 120 °C-on 20 percig sterilizáljuk: D-glükóz 2.0% Kukoricalekvár 3.0% É lesztőkivonat 0.1% NaNOa 0.3% KHaPO« 0.06% pH = 7.2 III) Tenyésztés Tíz előtenyészeti tápközeget beoltunk a No. 20A-77 Corynebacterium sp. mutánsának (FERM-BP 108) egy kacsnyi menynyiségével, és rézógépen (amplitúdó 71 mm, 270 ford./perc) 28 °C-on 18 órán át inkubélva rázott tenyészetet készítünk. A tíz inkubált tápközeget étoltjuk a szaporításhoz szolgáló tápközegre, amint 28 °C-on 22 órán át 0,5 térf./térf./perc levegóáramlás 400 ford./perc keveréssel tenyésztünk. (OD = optikai sűrűség = 19). 2) Az enzim kivonása Az inkubált tápközegből az 1) rész szerint kapott sejteket kicentrifugáljuk (Sharpless centrifuga, 10 000 g, 10 perc) és 0.1 mólos, 7.0 pH-értékre beállított trisz-pufferral mossuk (hasonló trisz-puffert használunk a továbbiakban is, ha másképpen nem jelezzük). A mosott sejteket 0,1 mólos triez-pufferban szuszpendáljuk, úgy, hogy a szuszpenzió OD-értéke 150 legyen, és a sejteket ultrahanggal feltárjuk (160 watt/80 ml, 7 perc). Az el nem roncsolt sejteket és a sejttörmeléket az ultrahangos feltárásnak alávetett oldatból kicentrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), így körülbelül 1 liter felülúszó részt kapunk (protein = 10,3 mg/ml, 25DKG-reduktáz = 0,63 egység/ml). 3) Az enzim tisztítása Az egész alábbi eljárást 4 °C-on vagy ez Blatti hőmérsékleten végezzük. I) Frakcionális ammónium-szulfáttal A 2) rész szerint kapott felülúszóhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és a kisózott termékei kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). Az így kapott felülúszóhoz 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, jéggel körülbelül 1 órán át hűtjük és a kicsapódott proteint kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). A proteint 200 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
