192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
8 192892 9 0,1 móloB trisz-pufferban faloldjuk és az oldatot éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk. II) Ioncserélő kromatográfia A fenti i) rész szerint kapott dializált oldatot (250 ml, 13,6 mg/ml protein) DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra (Pharmacia Finecheraicals Co.) visszük és az alábbi körülmények között kromatografáljuk: oszlopméret: 1,6x30 cm, kiegyensúlyozó folyadék 0,02 mólos trisz-puffer, eluens: 0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml) 0,15 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml) 0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml). Az eluátumból 5 ml-es frakciókat szedünk és minden egyes frakció enzimaktivitását megmérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra (a mérési módot az 5.)ii) részben fogjuk ismertetni). Ennek eredményeképpen mindkét szubsztrátumra észleltünk enzimaktivitást a 0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral eluált eluátum 80 ml-ében. Ezután az eluátumhoz a protein kisózása céljából 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, a kisózott termékei 30 ml 0,1 mólos trisz-pufferban feloldjuk és 4 °C- on éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk. III) Affinitás-kroraatográfia A 3.)ii) rész szerint kapott dializált oldatot Amicon Matrix Gel Red A oszlopra (Amicon Far East Limited gyártmánya) viszszük, amit előzetesen 0,02 mólos trisz-pufferral (pH - 7,0) egyensúlyba hoztunk, és az alábbi körülmények között kromatografáljuk: oszlopméret: 1,6x19 cm, mosófolyadék: 0,4 mólos nátrium-klorid/0,02 inólos trisz-puffer (pH = 7,0) (400 ml), eluens: 0,5 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (450 ml) 0,7 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (150 ml) 1 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml). Az enzimaktivitást megmérjük a megfelelő 5 ml-es frakciókból a 3.)ii) részben említettek szerint. Enzimaktivitást észleltünk mindkét szubsztrátumra, vagyis a 25DKG és 5KF szubsztráturaokra, a 0,7 mólos- 1 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) eluált 18 frakcióban. Az egyesített aktív frakciókhoz (90 ml) az oldat nátrium-klorid tartalmának csökkentése céljából 225 ml 0,02 mólos trisz-puffert (pH = 7,0) adunk, és a keveréket ismét Amicon Matrix Gel Red A oszlopra (1,9x13 cm) viszzük. Az oszlopot 120 ml 0,2 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) mossuk és 0,5 mmól NADPH-ot és 0,2 mól nátrium-kloridot tartalmazó 150 ml 0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 0,7) eluáljuk. Az eluátumot 5 ml-es frakciókra osztjuk és enzimaktivitásukat a fenti módon megmérjük. Ennek eredményeképpen azt találtuk, hogy a nagy enzimaktivitású frakciók (körülbelül 35 ml) azokban a frakciókban voltak (körülbelül 70 ml), amelyeket 0,5 mmól NADPH-ot éB 0,2 mól nétrium-kloridol tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral eluáltunk. IV) Az enzim koncentrálása és a NADPH eltávolítása A iii) rész szerint kapott eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk és ezt követően Phenyl Sepharose CL-4B oszlopra (0,9x3 cm, Pharmacia Fine Chemicals Co. gyártmánya) visszük, amit előzetesen 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a NADPH tökéletes eltávolítása céljából 30%-os telítettségben ammónium-BZulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral mossuk. Az eltávolítást a 340 nra-es mért abszorpció igazolja. Az oszlopon lévő enzimet 0,02 mólos trisz-pufferral, 1 ml-es frakciókat szedve eluáljuk. Ezeknek a frakcióknak az enzimaktivitását megmérve, nagy aktivitást észleltünk négy frakcióban. A négy frakciót egyesítve tisztított enzimoldatot kapunk és ezt használjuk a kövelkezó mérésekhez. Az oldat 54 egység/ml 25DKG-reduktáz aktivitást mutat, proteintartalma 0,58 mg/ml. 4) A tisztított enzimoldal tisztasága A 3) fejezet szerint előállított 2-5 pl tisztított enzimoldatot SDS-poliakril-amid-gélelektroforézissel (elválasztó gél: 10%-os akrilamid, az elektroforézis körülményei: 40 mA, szobahőmérsékleten, 1 órán át) analizáljuk, amikoris az enzim egyetlen sávot ad a 29.000±2.000 molekasúlynak megfelelő helyen. A továbbiakban gélszüréssel analízist végezve (Sephadex G-100), a 29.000±2.000 molekulasúlynak megfelelő frakciókban enzimaklivitást észlelünk. Ezután 5 pl enzimoldatot izoelektromos pont-elektroforézisnek vetünk alá (a gél poliakrilamid, az elektroforézis körülményei: a) 2,5-5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,1 mólos kénsav, katódelektrolit 0,1 mólos nótrium-hidroxid, 6 W, 2.700 Wh; b) 4,0-6,5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,04 mólos DL-glutaminsav, katódelektrolit 0,2 mólos nátrium-hidroxid, 25 W, 2.600 Wh, a hőmérséklet 18-20 °C. Az elektroforézis eredményeképpen az enzim egyetlen sávban vándorol, ami 4,4±0,2 pH-értéknek felel meg. A fentiekben ismertetett adatok megerősítik, hogy a tisztított enzimoldat egyedül 25DKG-reduktázt tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
