192869. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polivalens Escherichia Coli vakcina előállítására, a szopósmalacok coli hasmenésének megelőzésére
4 192869 5 terotoxinokkal szemben ad védettséget, ugyanakkor az oltóanyag enterotoxin tartalmának mérésére szolgáló eljárás meglehetősen bonyolult. A külföldön, így az NDK-ban használt antibakteriálÍB „Coliporc" vakcina (Monatshefte für Vet. Med, 1972. 27. 50-52) az ott gyakori E. coli szerotipusokat tartalmazza, s bár használata után a veszteségek a korábbinak kb. 1/3-ára csökkentek, mégis gyakran kellett az adott gazdaságra nézve tipusspecifikus vakcina használatához folyamodni, illetve a beteg malacokat antibiotikumokkal gyógykezelni. Az NSZK-ban forgalmazott, ugyancsak antibakteriális „Porcovac” (Béri. Münch, tierärztl. Wschr. 1980. 93. 224- -227; Infection and immunity 1982. 36. 900- -906) 12 E. coli szerotípust tartalmaz. Az oltóanyag hibája, hogy egyrészt túl sok, eltérő antigénszerkezetű törzset tartalmaz, másrészt egyes törzsek felületi antigénjei nem ismeretek. Az ugyanott forgalmazott anti-enterotoxikus „Ecopig" (Tierärztl. Umschau 1978. 33. 265; Béri. Münch, tierärztl. Vschr. 1980. 93. 224-227) tisztított hőlabilis enterotoxint tartalmaz. Hátránya, hogy csak a hőlabilis enterotoxin ellen nyújt védettséget. Az Angliában használt keresekedelmi forgalomban levő, antibakteriális, vagy kísérleti céllal előállított tisztított K88-as antigéneket tartalamzó vakcinák (Research in Vet. Sei. 1978. 24. 39-45), kísérleti viszonyok között jó eredményeket adtak, a gyakorlatban azonban mégsem terjedtek el. A Svájcban előállított, tisztított hölabilis enterotoxint tartalmazó „Septivac" vakcinát magunk is kipróbáltuk a malacok E. coli hasmenésének megelőzésére, minden eredmény nélkül. Kísérleti jellegű antibakterilális, vagy antitoxikus vakcinák forgalomban vannak Csehszlovákiában, Lengyelországban, Svédországban és számos más országban is. Mivel szerológiai vizsgálataink sorén kiderítettük, hogy a malacok E. coli hasmenését előidéző szerotípusok antigénszerkezetileg részben különböznek a másutt előfordulóktól, továbbá hogy a vakcinába foglalt törzsek kémiai feltárása a felületi antigének tönkretételével jár, valamint hogy a sertések számára készített vakcinák csíraszáménak, az antigénhatás fokozása érdekében, legalább egy kitevővel magasabbnak kell lennie, mint az az eddigiekben szokás, olyan új oltóanyagot állítottunk elő, amely alkalmas a malacok E. coli hasmenésének a megelőzésére. A találmány tárgya, eljárás polivalens Escherichia coli vakcina előállítására, amelynek lényege abban áll, hogy az általunk hazánkban izolált és identifikált az 0149:K91,88ac (MNG 00315); 0147:K89,88ac (MNG 00316, 0141:K85,88ab (MNG 00317); O108:K + (MNG 00318) és 09:F6 (MNG 00319) antigénszerkezetű törzseket külön-külön elszaporítjuk tápfolyadékben úgy, hogy 18-2411 tenyésztési idő múlva legalább 1010 baktérium/ml sűrűségű tenyészetet kapjunk, majd az egyes törzsek tenyészeteit külön-külön inaktivélva egyenlő térfogatarányban összekeverve, inaktivált, alumínium gélhez adszorbeált (csapadékos) vagy ásványi olajokban emulgeált vakcinának feldolgozzuk. A találmány szerinti eljárás foganatosításakor az alábbiak szerint járunk el. Az előbb felsorolt öt E. coli törzset külön-külön elszaporítjuk tépfolyadékban, vagy szilárd, agar táptalaj felületén. A tenyészeteket a szokásos módszerek és táptalajok felhasználásával állítjuk elő. Előnyös, ha a tápfolyadék 1% glükózt és 1% élesztőkivonatot is tartalmaz. A tenyésztést, levestáptalaj helyett végezhetjük szilárd táptalajokon is. Nagy baktérium törne g nyerése érdekében a tenyésztést 5-50 literes tenyésztőedényekben, vagy szilárd táptalajok használata esetén 2-5 literes Roux-palackokban célszerű végezni. A táptalajokat a sterilezés (50,7 kPa nyomáson félóra) után beoltjuk az egyes baktériumok néhány ml-nyi (5-50 ml) friss tenyészetével. Előzetesen immunsavókkal ellenőrizni kell az egyes törzsek felületi (K- és F-) antigénjeit. Csak a megadott felületi antigéneket tartalmazó törzsek használhatók az oltóanyag előállítására. A beoltott táptalajokat 37 °C-on, folyékony táptalajban történő tenyésztés esetén lassú keverés melr lett 18-241‘-ig tenyésztjük. Ha Bzilárd táptalajokon történt a tenyésztés, a baktérium tömeget a táptalaj felületéről 0,9%-os NaCl oldattal lemossuk. Mind a levestenyészetból, mind a lemosott baktériumszuszpenzióból csíraszámlálást végzünk, a tenyészetek sűrűségét egyformán 1 x 1010 baktérium/ml sűrűségűre állítjuk, ellenőrizzük a tenyészet tisztaságát, valamint a visszatenyésztett baktériumtörzsek antigénszerkezetét. Ezután a tenyészeteket 0,15% formalin hozzáadáséval 37 °C-on 24 óráig inaktiváljuk, majd ellenőrizzük a sterilitást. Az inaktivált, megfelelő sűrűségűre beállított, mind az öt törzset előnyösen egyenlő térfogati arányban tartalmazó baktériumtenyészethez a csapadékos vakcina előállításakor mintegy 20% mennyiségben (2,5-3,5 mg/ml végkoncentráció) alumínium-hidroxid vagy alumínium-foszfát gélt keverünk, miáltal csapadékos vakcinát nyerünk. Ezt követően a vakcina pH-ját 6,5-re állítjuk be. Az ásványi olajokkal (pl. Bayol F, Marcol 52, Shell olajok, fehér olaj, kozmetikai vazelin) adjuvált vakcinák előállításakor a baktériumtenyészethez egyenlő mennyiségben olyan ásványi olajat adunk, amelybe előzőleg 10-20%-os árnyában valamilyen (pl. Arlacel A, Tween 80) felületaktív anyagot keverünk. A keveréket mixerben homogenizáljuk mindaddig, amíg Btabil emulziót nyerünk, majd pH-ját 7-re állítjuk be. A polivalens, alumínium-gélhez adszoi— beált E. coli vakcinából 5 ml-t adunk vemhes kocának bőr alá egyszer 4 héttel, majd ismét 5 IC 15 20 25 30 35 43 45 50 55 60 65 4
