192869. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polivalens Escherichia Coli vakcina előállítására, a szopósmalacok coli hasmenésének megelőzésére
6 192869 7 2 héttel a várható elles előtt. Az olajjal adjuvált inaktivált vakcinák adagja ugyanezen időpontokban 2,5 ml, mélyen izomba. A vakcinák a vemhes kocákban ellenanyagtermelést indítanak meg, amely az újszülött malacokat a föcstejen keresztül megvédi életük első hetében a coli hasmenéstől. Olajos vakcina használatával a föcstejben az E. coli törzsek felületi antigénjeivel szemben megfelelő ellenanyagok mennyisége, az alumíniumgélhez adszorbeált vakcinákkal elérhető titerek 2-4-szerese. A vakcinák alkalmazásával az általunk vizsgált gazdaságok E. coli hasmenés miatti 15%-os veszteségei 5% alá voltak csökkenthetők. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákban ismertetjük. 1. példa Az 0149:K91,88ac (MNG 00315); 0147:K89,88ac (MNG 00316); 0141:K85,88ab (MNG 00317); 0108:K + (MNG 00318, és 09:F6 (MNG 00319) antigénszerkezetű törzseket külön-külön 5 literes tenyésztóedényekben készített, megfelelő összetételű, steril tápfolyadékba oltjuk, inoculuraként 5-5 ml friss levestenyészetet használva. A beoltott tenyészetet, lassú keverés mellett 37 °C-on 24i-ig keltetjük. Ezután a tenyészet 0,1 ml-éből 10- -es léptékű higítási sorozatot készítünk, s meghatározzuk a tenyészet csíraszámát, s egyúttal tárgylemezagglutinációs próbában immunsavókkal ellenőrizzük a kitenyésztett törzsek felületi antigénjeit. 1% glükózt és 1% ólesztókivonatot is tartalmazó pH 7,2-es tápfolyadék használata esetén a csíraszám eléri a 102 * * * * * * * 10 baktérium/ml sűrűséget. A tenyészetet ezután 0,15% formalin hozzáadásával 37 °C-on 24h-ig inaktiváljuk, majd táptalaj felületén történő szélesztéssel ellenőrizzük, hogy az oltóanyag steril-e. Az öt törzset tartalmazó tenyészetet, egyenlő térfogati arányban őszszeöntjük, aluminium-hidroxid gélhez adszorbeáltatva csapadékos vadcinává alakítjuk úgy, hogy az alumíniumgél koncentrációja 3,0 mg/ml legyen. Ezt követően a vakcina pH-ját 10%-os NaOH-al pH 6,5-re állítjuk. A kész oltóanyagot 100-500 ml vakcinás üvegbe dozírozzuk. 2. példa A 1. példában felsorolt E. coli törzseket nem tápfolyadékba, hanem 2-5 literes űrtartalmú Roux-palackokba merevített agar táptalaj felületére oltjuk úgy, hogy az inoculum kb. 5-5 ml-nyi mennyisége az agar felületét mindenütt ellepje. A beoltás után a felesleges folyadékot a táptalaj felületéről leöntjük. 24 órá3 keltetés után a baktériumtenyészetet steril üveggyönggyel lemossuk, meghatározzuk a csíraszámát, majd a szuszpenziók sűrűségét 1 x 1010 baktérium/ml sűrűségűre állítjuk. A továbbiakban az 1. pontban leírtak szerint készítjük el a vakcinát. A szilárd táptalajok használata munkaigényesebb, de gazdaságosabb, mert egységnyi felületről kb. ötször akkora baktériumtömeg nyerhető, mint folyékony közegben. 3. példa Az 1. példa szerint előállított, 1010 baktérium/ml sűrűségű, inaktivált tenyészetet összekeverjük 20% mennyiségben alumini jm-hidroxid géllel, vagy még célszerűbben alumínium-foszfáttal, jól összerázzuk, majd 24 órát szobahőn állni hagyjuk, s a pH-ját csak azután állítjuk be 6,5-re. A baktériumtenyészetek pH-ja a tenyésztés befejeztekor erősen savas, savas közegben az aluminium gélek adszorbeáló képessége jobb, mint magasabb pH-n, ezért az alacsony pH-n történő adszorbeáltatás a vakcina immunogenitását fokozza. 4. példa Az 1. példa szerint előállított 1010 baktérium/ml sűrűségű inaktivált tenyészetet összekeverjük egyenlő mennyiségben olajos adjuvánssal (pl. Bayol F és Arlacel A 85:15 arányú keverékével), a keveréket 5-20 ezres fordulaté mixerben homogenizáljuk, amíg stabil emulziót kapunk. Az emulzió pH-ját 7-re állítjuk be. Az így előállított vakcinával az E. coli törzsek felületi antigénjeivel szemben elérhető titerek 2-4-szer nagyobbak mint alumínium-gélhez adszorbeált vakcina használatakor. 5. példa A 4. példa szerinti emulziót fcarcol 52, Shell olajok, fehér olaj, kozmetikai vazelin, vagy egyéb ásványi olaj felhasználásával állítjuk elő. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás polivalens Escherichia coli vakcina előállításéra, azzal jellemezve, hogy az 0149:K91,88ac (MNG 00315); 0147:K89,88ac (MNG 00316); 0141:K85,88ab (MNG 00317); O108:K + (MNG 00318) és 09:F6 (MNG 00319) antigénszerkezetü törzseket külön-külón, tápfolyadékban, vagy célszerűbben szilárd agar felületén elszaporitjuk ml-enként legalább 1010 baktérium sűrűségű szuszpenziót előállítva, az egyes baktérium szuszpenziókat inaktiváljuk, majd az egyes baktérium szuszpenziókat egyenként 15-25% térfogati arányban egymással összekeverjük, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
