192842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás affinitás-szorbensek előállítására
7 192842 8 karboxil-védócsoportot, míg a heterociklusos aminocsoportok védelmére például terc-butoxi-karbonil-csoportot vagy más savérzékeny amino-vódőcsoportot használhatunk. Ezeket a további reaktiv csoportokat csak akkor kell védenünk, ha a kapcsolási reakció során szabad állapotban mellékreakciókat idéznének elő. A (III) általános képletű védett neurotranszmitter-karbonsavakat, azaz az aminocsoportot hordozó szénatomon karboxilezett neurolranszmittereket részben ismeri módszerekkel állíthatjuk elő, részben új eljárást dolgoztunk ki ezek szintézisére. A (III) általános képletű vegyűleteket vegyes anhidrid-módszerrel kapcsoljuk a (II) általános képletű hordozókhoz. A (III) általános képletű szabad karbonsavakat célszerűen klórhangyasav-elil-észterrel vagy klórhangyasav-izobutil-észterrel reagáltatjuk, és az így kialakított vegyes anhidridet előnyösen a képződési reakcióelegyben reagáltatjuk tovább a megfelelően előkészített (II) általános képletű hordozóval. A vegyes anhidrides kapcsolási módszer előnye a peptidkémiában ennél lényegesen szélesebb körben használt karbodiimides kapcsolási módszerrel szemben az, hogy jobb termeléssel jár, mellékreakciókat nem idéz elő, így egyértelműen jellemezhető kémiai szerkezetű szorbenseket eredményez. A kapcsolás lezajlása után a gélszuszpenzió pH-ját 7 és 7,5 közötti értékre állítjuk. A pH beállítására célszerűen alkálifém-hidroxidokat használunk. A szuszpenziót néhány órán át -5 °C és +5 °C közötti hőmérsékleten tartjuk, eközben célszerűen keverjük vagy rázzuk. Ha poliszacharid-típusú hordozóanyagból indultunk ki, a gélt a vódőcsoportok lehasítása előtt vízmentesítenünk kell. A vízmentesítéshez acetont, acélon és diklór-metán elegyét, illetve diklór-metánt használunk. A kapott vízmentes gélt ezután diklór-metános közegben trifluor-ecelsavval kezeljük. Ebben a lépésben a védőcsoportok a gélszerkezet károsodása nélkül távolíthatók el. A savas kezelés után a gólt kimossuk, majd növekvő mennyiségű vizet tartalmazó vizes acetonnal, végül vízzel kezelve rehidratáljuk. A rehidratált gélt a szokásos körülmények között, anlioxidánst és gombaölőszert tartalmazó vizes pufferoldatban, fénytől védve, hűvös helyen tároljuk. Ha akrilamid-kopolimer hordozóból indultunk ki, a gél vízmentesítésére nincs szükség. Minthogy ez a kopolimer savakra lényegesen kevésbé érzékeny a poliszacharidoknál, a védőcsoport lehasítására savként más alkalmas erős, vízmentes savat, például ecetsavat, vagy ecetsav és 1,5 N vizes sósavoldat elegyét is használhatjuk. A savas kezelés után a gélt mossuk és szárítjuk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Amennyiben az aminoaavak konfigurációját külön nem közöljük, azok természetes (L) konfigurációjúak. A végtermékeket a felhasznált polimerre vonatkoztatva 100%-os kitermeléssel kapjuk. Minthogy az immobilizálandó vegyületet mindig igen nagy (8-10 szeres) feleslegben használjuk fel., a végtermék hozama a bevitt immobilizálandó vegyületre vonatkoztatva körülbelül 10-12%. Az immobilizált biológiailag aktív vegyület koncentrációját a hordozón - ami az affinitás-szorbens jellemző minőségi adata - minden példában közöljük. 1. példa 1,5 millimól (470 mg) BOC-3,4-dihidroxi-fenil-szerint 1 ml, előzetesen nitrogénnel álbuborékoltatott, vízmentes dimetil-formamiiban oldunk, és az oldatot -10 °C-ra hűljük. Az oldathoz 1,5 millimól (210 pl) vízmentes trietil-amint és 1,5 millimól (195 pl) klórhangyasav-izobutil-észtert adunk, és az elegyet 5-10 percig -10 ®C-on keverjük. A képződött vegyes anhidridet elkülönítés nélkül adjuk az alábbi módon előkészített hordozóhoz: 50 g amino-hexil-agarózt tízszer 200 ml desztillált vízzel mosunk, majd azonos térfogatú dimetil-formamid 5, 10, 20, 40%-os vizes oldatával egyszer-egyszer mossuk. A maximális dimetil-formamid töménység 40%. Ezután a hordozót térfogatával azonos mennyiségű 2:1:2 térfogatarányú dimetil-formami J : víz : aceton eleggyel kétszer mossuk, majd térfogatával azonos mennyiségű ugyanilyen összetételű oldószer-elegyben szuszpendáljuk, és a szuszpenzi.ót 0 °C-ra hűtjük. A vegyes anhidrid hozzáadása után a szaszpenzió pH-ját 0,01 mólos vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,0-7,5-re állítjuk, majd 4 órán át 0 °C-on rázzuk. A pH-t óránként ellenőrizzük. 4 óra elteltével a gélt vele azonos térfogatú 2:1:2 térfogatarányú dimetil-formamid : víz : aceton eleggyel ötször, ezután desztillált vízzel ötször mossuk, majd a következőképpen vízraentesítjük: 1 térfogatrész gélt 2-2 térfogatrész, növekvő mennyiségű (5, 10, 20, 40, 60, 80 térfogat%) acetont tartalmazó vizes acetonnal, majd 2 térfogatrész vízmentes acetonnal mosunk. Ezután 1 térfogatrész gélt 2-2 tériíogatrész, növekvő mennyiségű (5, 10, 20, 40, 60, 80 térfogat%) diklór-metánt tartalmazó aceton - diklór-metán eleggyel, végül vízmentes diklór-metánnal mosunk. Az oldószert vízsugár-vákuumban leszívatjuk, a gélt vele azonos térfogatú, 0 ’C-ra hűtött 1:1 térfogatarányú trifluor-ecetsav : diklór-metán elegyben szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 2 órán át gyengén rázzuk. 2 óra elteltével a gélt leszűrjük, és vízmentes diklór-metánnal kétszer, csökkenő mennyiségű (95, 80, 60, 40, 20, 10, 5 lérfogal%) diklór-metán: aceton eleggyel egyszer-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
