192741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új neplanocin antibiotikumok előállítására
15 192741 16 1. példa 2% glükózt, 2% keményítőt, 1% élesztőkivonatot, 1% kazein-hidrolizátomot és 0,2% kalciumkarbonátot tartalmazó 100 ml 6,5 pH-jú vizes táptalajt 500 ml-es lombikba töltve, 120 °C-on 15 percig sterilizáljuk. Két ilyen lombikot Ampullariella sp. A 11 079 FERM-P 4494 sz. törzs ferde tenyészetéből egy kacsnyival beoltunk, és rázás közben 30 °C-on inkubáljuk. Az inkubált folyékony táptalajt 4 nap múlva 20 liter, ugyanilyen sterilizált táptalajt tartalmazó 30 literes fermentorba töltjük, és percenként 300 fordulattal keverve és percenként 20 liter levegővel levegőztetve, 48 óra hosszat 30 °C-on tenyésztjük. Az igy inkubált tenyészetet 4% glükózt, 1% szójalisztet, 0,4% húskivonatot, 0,4% peptont, 0,1% élesztókivonatot, 0,25% nátriumkloridot és 0,1% kalciumkarbonátot tartalmazó 6,5 pH-jú 200 liter folyékony táptalajra töltjük, és percenként 180 fordulattal keverve és percenként 130 liter levegővel levegőztetve, 30 °C-on 40 óra hosszat tenyésztjük. A mintegy 200 liter térfogatú tenyésztett folyékony táptalajt szűréssel elválasztjuk, és a micéliumtőmeget vízzel mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot egyesítve, körülbelül 140 liter víztiszta szüredéket kapunk (hatékonysága neplanocin A-ként számítva 57 mcg/ml). 2. példa Az 1. példa szerint előállított szüredéket 20 liter, hidrogénalakban levő Amberlite IR-120 kereskedelmi nevű kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopra töltve az anyagot adszorbeáljuk és 100 ml vízzel mossuk. 3,7 n ammónia-oldattal eluálunk, és az első 30 liter eluátumot kiöntjük. A kővetkező 90 liter eluátumot összegyűjtjük, pH-ját 6 n sósavval 8-ra állítjuk be, majd 4 liter aktívszenet tartalmazó oszlopon vezetjük át, vízzel mossuk, és 90 liter, 70%-os vizes metanollal eluálunk. Az igy kapott eluátomot csökkentett nyomáson bepárolva, 1,5 liter sűrítményt kapunk. A sűrítményt 10 liter hidroxid alakban levő Amberlite IRA-410 kereskedelmi nevű ioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük fel, vízzel eluáljuk, és az eluátum pH-ját 4 n sósavval 7-re állítjuk be. Az eluátomot vákuumban bepárolva, a terméket hűtés közben leválasztva és szűréssel elválasztva, 41,8 g nyers neplanocin A-t kapunk (tisztasága körülbelül 12%). A 41,8 g nyers neplanocin A-t kevés vízben oldjuk, és 8,3 x 40 cm méretű, 10 : 0,2 : 1 arányú n-butanol 28%-os ammónia-víz eleggyel nedvesített 2 liter kovasavgélt tartalmazó oszlopra visszük fel, majd ugyanilyen oldószereleggyel eluálunk. 150 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik eluátumot frakcionáljuk; a hatékony terméket a 24-52. sz. frakcióban találjuk. Ezeket a frakciókat egyesítve, vákuumban bepároljuk, és a maradékot hűtés közben állni hagyjuk. A kivált csapadékot szűréssel elválasztva, 2,6 g nyers, kristályos neplanocin A-t kapunk. Kitermelés 32%. A nyers neplanocin A-t 60 ml forró vízben oldjuk, és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált fehér tűkristályokat szűréssel elválasztva, 2,01 g neplanocin A kristályokat kapunk. Kitermelés 25,2%. 3. példa Az 1. példa szerint előállított és neplanocin C-re számított 300 mcg/ml hatékonysága, 140 liter szüredéket a termék adszorbeálására Amberlite IR-120 kereskedelmi elnevezésű hidrogénalakban levő kationcserélő gyantát tartalmazó 20 literes oszlopon vezetjük át, és mintegy 100 liter vízzel mossuk. 3,7 n vizes ammóniaoldattal eluálunk, és az első 20 iter eluátumot kiöntjük. Az ezután következő 100 liter eluátumot összegyűjtjük, pH-ját tömény sósavval 8-ra állítjuk be, majd oszlopban levő 4 liter aktívszénen vezetjük át, vízzel mossuk, és 70 liter 70%-os metanollal eluláljuk. Az igy kapott eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva, 1,5 liter sűrítményt kapunk. A sűrítményt fagyasztva szárítással, 83,6 g, 29,5% tisztaságú, poralakú nyers termék marad vissza. 83 g poralakú nyers terméket vízzel telített n-butanolban oldjuk, és az oldatot 2 liter kovasavgéllel töltött és n-butanollal nedvesített 8,3 x 40 cm méretű oszlopra visszük fel, majd 10 : 0,2 : 1 arányú n-butanol-tőmény ammónia-víz oldószereleggyel eluáljuk. 150 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik eluátumot frakcionáljuk. Hatékony terméket az 53-108. számú frakcióban találunk. Ezeket a frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és a maradékot alacsony hőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált csapadékot szűréssel elválasztva, fehér kristályok alakjában 18,2 g neplanocin C-t kapunk. Tisztasága 96%. Kitermelés 41,6%. Ezt a terméket forró vízben oldva és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyva, a színtelen lemezes kristályok alakjában kivált neplanocin C-t szűréssel elválasztva, tiszta neplanocin C-t kapunk. 4. példa Az 1. példa szerint előállított szüredékhez 3,6 kg porított aktivszenet adunk, 40 percig keverjük, majd az aktivszenet szűréssel eltávolítjuk, és vízzel alaposan mossuk. Az eluálást. 70%-os metanollal hajtjuk végre. 40 liter eluátumot vákuumban szárazra párolva, neplanocin D-t tartalmazó 80 g poralakú nyers terméket kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
